El hecho de que un contenido como “la célula” ocupe espacio y tiempo en la currícula no se debe sólo a su importancia como contenido de la biología, sino también a la dimensión que alcanza la célula en el nuevo contexto de desarrollo tecnológico y social. Por ejemplo, para comprender los procesos que emplea la biotecnología moderna y sus aplicaciones actuales y futuras, es preciso comprender la estructura y el funcionamiento celular.
Comprender un objeto invisible a simple vista como la célula requiere de la construcción de una imagen (funcional y estructural) o de una representación abstracta con relaciones y procesos complejos.
¿Cómo se estudia la célula?
Hoy en día existe mucha información disponible acerca de qué es una célula, si es procariota o eucariota, cuáles son sus componentes, su forma, su función, etc. De hecho, estos contenidos son habituales y básicos en la enseñanza escolar. Pero, estudiar la estructura y el funcionamiento celular no es una tarea sencilla. Para lograrlo, hay que entrar en un mundo microscópico a través de numerosas herramientas, desde las más sencillas como el microscopio óptico, hasta técnicas más sofisticadas que permiten discernir la estructura de las macromoléculas, sus movimientos y funciones. Los conocimientos actuales acerca de las células son el resultado de observaciones, teorías y modelos que se fueron construyendo y modificando a lo largo de años de investigación, un proceso que aún continúa.
Estructura de una célula eucariota animal.
Los modelos científicos
La ilustración es un modelo que representa la estructura de una célula eucariota animal. Los modelos científicos se caracterizan porque son construcciones de la mente humana, y representan ideas o conceptos que se tienen sobre algún aspecto de la realidad. Los modelos científicos cumplen un papel importante en la construcción del conocimiento y la comprensión de los fenómenos naturales. Ayudan a predecir, describir y explicar fenómenos naturales, objetos y estructuras; y simplifican las observaciones haciendo más fácil trabajar con ellos, especialmente cuando se trata de objetos que no se perciben a simple vista, como una estructura microscópica.
¿Cómo se llega a determinar un modelo de la célula que no solo representa su estructura sino también su función? Sin duda, el desarrollo de instrumentos ópticos cada vez más precisos y de técnicas moleculares de visualización, han desempeñado un papel preponderante en estos logros científicos ya que permitieron conocer lo inalcanzable para el ojo humano.
Un poco de historia…
Ya en la antigüedad se sabía que el tamaño de los objetos podía aumentarse empleando espejos curvos y esferas de cristal llenas de agua. A principios del siglo XVII se inició una serie de experiencias utilizando lentes con el objetivo de lograr el mayor aumento posible. Estas experiencias se inspiraron en el uso del telescopio que había sido empleado por primera vez en 1609 por Galileo con fines astronómicos.
Con el desarrollo de los microscopios, la biología experimentó una revolución, ya que hasta entonces los organismos más pequeños descriptos eran los insectos diminutos. A partir de entonces, el desarrollo y complejización de los microscopios (palabra que en griego significa “para ver lo pequeño”) fue constante.
En 1665, el científico Robert Hooke publicó un libro llamado Micrographia; en el que pueden encontrarse algunos de los mejores dibujos que se hallan hecho de observaciones microscópicas. Una de sus observaciones simples pero más importantes fue la de un delgado trozo de corcho, un material muy liviano y firme que flotaba en agua, por razones desconocidas hasta entonces. A través de su microscopio Hooke observó que estaba constituido por una fina trama de pequeñas celdas a las que él llamó “células”, un término habitual para designar pequeñas habitaciones en los monasterios.
Microscopio usado por Hooke y el dibujo de las “células” del tejido de corcho
Más tarde, el aficionado holandés Anton van Leeuwenhoek logró, mediante las lentes pequeñas que él mismo fabricaba, aumentos de hasta 270 veces. Así pudo, entre otras cosas, descubrir y estudiar por primera vez a pequeños organismos invisibles a simple vista, presentes en aguas estancadas, a los que nombró “animálculos”. Hoy se sabe que observó
desde células bacterianas hasta protozoos en aguas estancadas, espermatozoides y glóbulos rojos.
¿Qué es un microscopio?
El microscopio es una de las herramientas básicas en el estudio de la biología. Mediante un conjunto de lentes, el microscopio aumenta el tamaño de objetos que son demasiado pequeños para ser visualizados a simple vista. Dos principios están involucrados en el uso del microscopio: la magnificación (capacidad de aumentar el tamaño de una imagen) y la resolución (capacidad de producir una imagen nítida, o la capacidad del instrumento para dar imágenes bien definidas de puntos situados muy cerca uno del otro). Existen distintos tipos de microscopios, cada uno con un propósito particular, ya que cada técnica de microscopía permite observar estructuras dentro de cierto rango de tamaño, dependiendo del límite de resolución del microscopio empleado, es decir, la separación mínima que permite que dos objetos puedan ser distinguidos como diferentes.
Los microscopios actuales
Desde su invención, la microscopía ha experimentado increíbles adelantos, aumentando no solo su capacidad de resolución sino también el poder de amplificación. Se los puede clasificar en dos grandes grupos: microscopios ópticos y microscopios electrónicos.
La gran diferencia entre ambos tipos es la “radiación” que emplean para iluminar el objeto de interés y el límite de resolución, que depende de las características físicas de la radiación empleada (luz visible o electrones). En el caso de los microscopios ópticos, la radiación utilizada es la luz visible. En los microscopios electrónicos, la radiación es un haz de electrones, posibilitando un poder de resolución de 0,1nm.
Los microscopios ópticos
Estructura del microscopio óptico (A: esquema; B: foto). (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).
Consta de una o más lentes, y su factor limitante son las características físicas de la luz visible (su longitud de onda). De todas formas, pueden aumentar el tamaño de un objeto por encima de las 2.000 veces. Algunas partes del microscopio óptico son: OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador, que amplía la imagen del objetivo; OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación, que amplía la imagen de ésta; CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación (o espécimen a estudiar).
Es el tipo de microscopio más utilizado, y emplea la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto.
Variantes en la microscopía óptica
En la microscopía óptica se pueden distinguir variantes que ofrecen diferentes imágenes de un mismo objeto de estudio. Según cuál es el material de estudio, sus características y el objetivo de quien lo examina, se elegirá una u otra técnica. A continuación se muestran cuatro imágenes de la misma célula (un fibroblasto en cultivo) generada mediante diferentes técnicas de microscopía óptica, que se explican a continuación:
Variantes en la microscopía óptica
En la microscopía óptica se pueden distinguir variantes que ofrecen diferentes imágenes de un mismo objeto de estudio. Según cuál es el material de estudio, sus características y el objetivo de quien lo examina, se elegirá una u otra técnica. A continuación se muestran cuatro imágenes de la misma célula (un fibroblasto en cultivo) generada mediante diferentes técnicas de microscopía óptica, que se explican a continuación:
A) Microscopía de campo brillante (B) Microscopía de contraste de fase (C) Microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC) – Nomarski. (D) Microscopía de campo oscuro (tomada de Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004)
A) Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que están naturalmente coloreados, o simplemente contornos.
B) Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para especimenes delgados, o células aisladas. El tipo de iluminación que emplea provoca variaciones en cómo refractan la luz algunos especimenes “invisibles”, haciéndolos visibles. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina.
C) Microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC) – Nomarski: Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Se usa cuando la muestra es muy gruesa para usar contraste de fases. Fue diseñado para observar relieves de especimenes difíciles de manejar. Es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales.
D) Microscopía en campo oscuro: el microscopio utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. Las porciones claras del ejemplar aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal.
Fijación, corte y tinción de muestras
Para que una muestra de tejido permanezca intacta en el tiempo, y permita así su observación al microscopio todas las veces que se desee, hay que “fijarla”. Esto significa, tratar a las células con un fijador que las inmovilice y las preserve. Luego, dado que la mayoría de los tejidos son muy gruesos como para poder observar sus células individualmente a alta resolución, se los debe cortar en pequeñas láminas o secciones con un instrumento denominado “micrótomo” (figura). Debido a que los tejidos son generalmente blandos y frágiles (aún fijados), necesitan ser embebidos en un medio que actúe de soporte para poder seccionarlo. Generalmente se emplea parafina (también algunas resinas), que en su estado líquido penetra el tejido fijado, para luego solidificarse y así formar un bloque sólido junto a la muestra.
Esquema de un micrótomo. Una porción de tejido embebido en parafina es seccionada con una cuchilla de acero para luego teñir y observar al microscopio óptico. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004)
Una vez obtenidas las secciones, usualmente el siguiente paso es teñirlas con colorantes específicos que poseen afinidad por distintos componentes celulares, permitiendo su identificación al microscopio. Algunos ejemplos de colorantes muy empleados son la hematoxilina y la eosina. El primero tiene afinidad por las moléculas cargadas negativamente, por lo que se emplea para teñir los núcleos celulares (por su contenido de ADN) que adquieren un color violáceo. El segundo tiene afinidad por las sustancias básicas, otorgando un color rosado al citoplasma celular cuya carga neta es positiva.
Sección de tejido teñida observada con un microscopio óptico de campo brillante. La sección observada corresponde a las células de los conductos colectores de orina del riñón, y fue teñida con una combinación de hematoxilina y eosina. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).
E) Microscopía de campo brillante con tinción: Los colorantes específicos aumentan el contraste y revelan detalles que no se aprecian de otra manera.
Sección de tejido teñida observada con un microscopio óptico de campo brillante. La sección observada corresponde a las células de los conductos colectores de orina del riñón, y fue teñida con una combinación de hematoxilina y eosina. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).
Microscopía de fluorescencia. Se observa una micrografía de una célula en mitosis. Para obtener esta imagen, se emplearon tres moléculas fluorescentes distintas con el fin de teñir tres componentes celulares diferentes. Se usó un anticuerpo acoplado a una proteína fluorescente verde para detectar a los microtúbulos, otro anticuerpo acoplado a una proteína fluorescente roja para detectar a los centrómeros, y un colorante fluorescente azul para teñir el ADN, que se encuentra condensado formando los cromosomas. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).
G) Microscopía confocal: permite obtener imágenes tridimensionales, a diferencia de la microscopía óptica. El microscopio óptico convencional enfoca un determinado “plano focal” dentro de una estructura tridimensional; por encima y por debajo de dicho plano la muestra está iluminada pero no en foco, y esto genera una imagen borroneada. El microscopio confocal combina dos enfoques: óptico y computacional. Esto elimina las imágenes provenientes de otros planos que no sean los que se desea enfocar en cada momento. Las imágenes se integran mediante computadoras para obtener una imagen tridimensional.
Comparación de la microscopía fluorescente convencional y confocal. Las dos imágenes se obtuvieron del mismo estadio de desarrollo de un embrión de la mosca Drosophila, donde se tiñeron los filamentos de actina de las células con un colorante fluorescente. (A) En la microscopía convencional, la imagen es borrosa debido a la presencia de estructuras fluorescentes por encima y por debajo del plano de foco. (B) en la imagen confocal, la información “fuera de foco” es removida, resultando en una observación nítida de la sección de células del embrión (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004)
Los microscopios electrónicos
Desarrollados a partir de 1930, permiten una ampliación del objeto mucho mayor que el microscopio óptico, con muy alta capacidad de resolución. Permiten observar virus y organelas subcelulares, entre otras estructuras. Básicamente, dos tipos de microscopios electrónicos fueron desarrollados para diferentes usos:
A) Microscopio electrónico de transmisión (MET): proyecta electrones (partículas subatómicas con carga negativa) a través de una fina capa de tejido o material a observar. Al hacerlo, produce una imagen en dos dimensiones sobre una pantalla fosforescente, donde el brillo en un área particular de la imagen es proporcional al número de electrones que son transmitidos a través del material.
B) Microscopio electrónico de barrido (MEB): da como resultado una imagen que parece tridimensional. Emplea dos o tres puntos de la muestra donde llegan los electrones que escanean la superficie del espécimen a observar y salen del mismo siendo detectados por un sensor.
2. Imagen de bacterias E. Coli a través de microscopio electrónico de barrido. Se genera una imagen tridimensional (aumentos 22.810x) http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery/fungi-sm1/92386a.html.
Los colores de las imágenes no son reales, ni producto de colorantes, sino que se generan artificialmente mediante programas de diseño para destacar el objeto de interés.
De lo expuesto se concluye que se optará por uno de los tipos de microscopía descriptos según el objetivo de estudio, el tamaño de las estructuras que permiten visualizar, el detalle que aportan, las moléculas que permite distinguir, entre otros criterios. El siguiente esquema muestra las posibilidades que ofrecen los diferentes aparatos ópticos en relación con la resolución del ojo humano.
Se compara el poder de resolución de los diferentes microscopios y del ojo humano. La escala graficada es logarítmica (Adaptado de Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004)
¿Cómo se estudian las moléculas que integran la célula?
Muchos procesos celulares pueden estudiarse combinando las técnicas microscópicas con otras herramientas. Actualmente se dispone de técnicas que permitan detectar, medir y realizar seguimientos de casi todas las moléculas presentes en una célula viva. Entre ellas:
Proteínas fluorescentes: El descubrimiento de proteínas fluorescentes presentes en distintos organismos, como la Proteína Verde Fluorescente (GFP en inglés) extraída de:
- Aequoria victoria, abrió paso a innumerables aplicaciones en el campo de la biología celular. La caracterización del gen que la codifica permitió, por ingeniería genética, emplearla como “etiqueta” para señalar otra proteína de interés a la cual se fusiona. Un ejemplo se puede observar en la microfotografía de plantas transgénicas de la especie modelo Arabidopsis thaliana que lleva una nueva proteína resultante de la unión de la proteína GFP con otra proteína de estudio denominada “talina”. De esta forma, se puede estudiar en un organismo completo la ubicación y el comportamiento de una proteína particular.
Estudio de proteínas por fusión a la proteína GFP
A) la superficie de las hojas de Arabidopsis cubiertas de estructuras glandulares llamadas tricomas. (B) la microscopia confocal MEB permite observar la proteína “talina” debido a su unión con la proteína fluorescente verde GFP. En rojo se observa la autofluorescencia de la clorofila. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).
A) la superficie de las hojas de Arabidopsis cubiertas de estructuras glandulares llamadas tricomas. (B) la microscopia confocal MEB permite observar la proteína “talina” debido a su unión con la proteína fluorescente verde GFP. En rojo se observa la autofluorescencia de la clorofila. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).
Uso de radioisótopos para seguir el destino de moléculas en la célula :
Las moléculas pueden ser marcadas o etiquetadas con isótopos radioactivos. Los isótopos constituyen variantes de los diferentes elementos químicos que cambian en la masa de su núcleo, aunque poseen el mismo número de protones y de electrones, y las mismas propiedades químicas. Los isótopos radioactivos, o radioisótopos, tienen un núcleo inestable que se desintegra para producir un tipo de átomo diferente. En el transcurso de la desintegración se pueden liberar distintos tipos de radiaciones (por ejemplo, rayos gama) que son detectadas por dispositivos especiales. Dado que existen radioisótopos de muchos de los elementos que componen a la mayoría de las moléculas presentes en la célula, se han desarrollado técnicas para el seguimiento y localización de moléculas específicas, tanto bioquímicamente como microscópicamente. Una de las primeras aplicaciones de la radioactividad en biología fue el seguimiento de la ruta del elemento carbono durante la fotosíntesis en la síntesis de carbohidratos. Luego se comenzó a emplear para seguir cualquier proceso en las células.
En un experimento típico, las células son suplementadas con una molécula precursora en su forma radioactiva que se mezcla con las moléculas no marcadas preexistentes. Así, todas siguen el mismo camino ya que son “vistas” por la maquinaria celular como la misma molécula. Otro de los usos importantes de la radiactividad en la biología celular es la localización de un compuesto radiactivo en la célula o en un tejido por autoradiografía. Brevemente, las células se incuban en presencia de la molécula radioactiva durante un lapso breve de tiempo, y luego se las fija para su observación microscópica. Se las cubre posteriormente con una capa delgada de emulsión fotográfica, y luego de varios días en oscuridad se puede revelar y se observará la localización de la radiactividad en cada célula.
En un experimento típico, las células son suplementadas con una molécula precursora en su forma radioactiva que se mezcla con las moléculas no marcadas preexistentes. Así, todas siguen el mismo camino ya que son “vistas” por la maquinaria celular como la misma molécula. Otro de los usos importantes de la radiactividad en la biología celular es la localización de un compuesto radiactivo en la célula o en un tejido por autoradiografía. Brevemente, las células se incuban en presencia de la molécula radioactiva durante un lapso breve de tiempo, y luego se las fija para su observación microscópica. Se las cubre posteriormente con una capa delgada de emulsión fotográfica, y luego de varios días en oscuridad se puede revelar y se observará la localización de la radiactividad en cada célula.
