Biología 710

Introducción al metabolismo general

2008-08-11T08:47:00.006-03:00

Recorrer un lugar desconocido, especialmente una gran ciudad, puede ser desconcertante. Calles, avenidas, cruces, rutas, atajos, puentes, etc. Seguramente habrá más de una ruta posible que conduzca a destino. Algunas serán cuesta arriba, e implicarán un gran gasto de energía, mientras que otros caminos serán cuesta abajo, y exigirán menor desgaste. Contar con un mapa puede ser de gran ayuda.
Se puede considerar que las moléculas presentes en cada célula se comportan como viajantes en una ciudad. Las reacciones celulares en las que están implicadas esas moléculas definen un mapa bastante complejo, llamado metabolismo celular (ver Figura 1). El metabolismo celular está constituido por el conjunto de reacciones y procesos físico-químicos que ocurren en la célula. Algunas moléculas están involucradas en rutas que implican gasto de energía, mientras que otras van “cuesta abajo”, liberando energía.

Fig 1Mapa de rutas metabólicas celulares y sus conexiones.
Fuente: Molecular Biology of the Cell. Alberts, et al. Fourth edition

El esquema muestra la complejidad del metabolismo, en el cual las reacciones no están aisladas, sino que se encuentran relacionadas unas con otras. La conexión entre diferentes rutas se establece a partir de los metabolitos, sustancias intermedias, que resultan de las diferentes reacciones. En una única célula ocurren miles de reacciones químicas y su variedad es enorme. Sin embargo, las diferentes reacciones del metabolismo celular integran una red coordinada de transformaciones que presentan muchos aspectos en común. Todas las células tienen la capacidad de degradar sustancias y extraer de ellas energía, así como también de sintetizar macromoléculas (carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos) a partir de sus respectivas unidades (monómeros), y almacenar energía en sus uniones químicas.

Anabolismo y Catabolismo

El metabolismo está constituido por dos tipos de reacciones básicas: las anabólicas y las catabólicas.
Anabolismo: Es el conjunto de reacciones con las que los organismos vivos sintetizan (fabrican) las biomoléculas que los componen, hidratos de carbono, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (ver Cuaderno Nº32), a partir de compuestos presentes en la célula. La energía necesaria para reacciones anabólicas es provista por moléculas de ATP (Adenosina Tri-Fosfato). La fotosíntesis, biosíntesis de ácidos grasos y aminoácidos son ejemplos de rutas anabólicas.
Catabolismo: Es el conjunto de reacciones de degradación a través de las cuales los seres vivos obtienen energía. Los polímeros o biomoléculas presentes en las células son transformadas en moléculas más simples (orgánicas o inorgánicas), como el piruvato, ácido láctico, amoniaco y CO2. La energía contenida en los enlaces de las moléculas degradadas es liberada y luego almacenada en los enlaces fosfato de alta energía del ATP. La β-oxidación de ácidos grasos, la glucólisis, la fermentación y la respiración celular son ejemplos de rutas catabólicas.

Fig 2 Relación entre reacciones catabólicas y anabólicas. Las reacciones anabólicas y catabólicas dependen unas de otras, energéticamente y desde el punto de vista de la materia. La energía liberada por unas es usada por las otras, y los productos de unas son materia prima de las otras.

Relación entre energía y metabolismo

La energía se define como la capacidad para realizar un trabajo. En particular los seres vivos recurren a la energía química contenida en las uniones de las moléculas, para sus reacciones metabólicas. Según el enunciado de la primera ley de la termodinámica, la energía no se crea ni destruye, se transforma. Es decir que la energía no se “produce” sino que se convierte de una forma en otra. Por ejemplo, de energía lumínica en química, de energía química en calórica.
La energía liberada durante una reacción representa energía útil para alguna otra. La energía libre de Gibbs, expresada con la letra”G”, es la energía liberada durante una reacción, que es utilizable para realizar un trabajo. El cambio de energía libre (ΔG) de una reacción, denota si la reacción puede ocurrir de forma espontánea o no.
Dada una reacción en la que el sustrato “X” se transforma en el producto “Y”: ¿Cómo saber si esa reacción ocurre espontáneamente?

Si el ΔG de la reacción es negativo, se trata de una reacción espontánea (el producto “Y” posee menor energía libre que el sustrato “X”). Las reacciones catabólicas son espontáneas porque los productos se encuentran en un nivel energético menor al de los sustratos, hay liberación de energía.

Si el ΔG de la reacción es positivo, se trata de una reacción no espontánea (el producto “Y” posee mayor energía libre que el sustrato “X”). Las reacciones anabólicas son no espontáneas, los productos tienen más energía que los sustratos, se encuentran más “ordenados” (tienen menor entropía) y por ende son más inestables.
Ahora, las reacciones no espontaneas también ocurren en la células. Una reacción termodinámicamente no favorable ocurre si, y sólo si, se le acopla una reacción espontánea, cuyo excedente de energía sea mayor que la necesaria para la reacción no espontánea.
Otro aspecto a considerar es el efecto regulatorio que ejerce la energía celular sobre el metabolismo. En situaciones donde la carga energética abunda, las rutas catabólicas son inhibidas o “apagadas” por moléculas ricas en energía, como el ATP y el NADH. ¿Para que seguir produciendo energía si hay suficiente? En el caso inverso, si la célula se encuentra “hambreada” las moléculas que denotan déficit de energía (ADP y NAD+) activan las rutas catabólicas. La regulación metabólica define que sólo se produzca energía en caso de ser necesaria.

Moléculas transportadoras de energía

Los seres vivos, desde el organismo más simple hasta el más complejo, necesitan un aporte permanente de energía. Algunas reacciones producen energía, mientras que otras la consumen. ¿Cómo acurre esa transferencia de energía entre distintos tipos de reacciones metabólicas? Usualmente, la energía liberada durante reacciones catabólicas se almacena en enlaces de alta energía de moléculas transportadoras. De esta manera, se producen compuestos que almacenan la energía en su estructura. El ATP (Adenosín trifosfato) es la “moneda de energía” más frecuente en los seres vivos. Está compuesta por una base nitrogenada (Adenina), un azúcar (ribosa) y tres grupos fosfato. Es un tipo de nucleótido que contiene enlaces fosfato de alta energía, y lábiles (que se rompen con facilidad y ceden su energía).
El ATP provee de energía para:

Síntesis de polímeros o moléculas complejas.
Trabajo mecánico en la contracción muscular
Transporte activo a través de membranas.
Movimiento celular (cilias, flagelos, movimiento de cromosomas, etc.)
La hidrólisis del ATP en ADP (adenosin difosfato) o AMP (adenosin monofosfato) libera grandes cantidades de energía, que es aprovechada por reacciones que la absorben para llevarse a cabo.

Fig 3. Hidrólisis del ATP y producción de energía.
Fuente: ArgenBio

La transformación de ATP en ADP y AMP es un mecanismo sumamente dinámico, que responde a las necesidades energéticas de la célula. De hecho, la hidrólisis del ATP es reversible, y las tres formas de adenina-fosfato son interconvertibles entre sí.

El metabolismo es organizado por enzimas

Los sustratos de una reacción están separados de sus productos por una barrera energética llamada energía de activación. La velocidad con la que transcurre una reacción en ausencia de catalizadores (aceleradores) es muy baja, ya que sólo las moléculas con energía mayor o igual a esa barrera energética lograrán formar producto. De hecho, las actividades metabólicas no pueden llevarse a cabo a un ritmo que permita la vida, sin la presencia de las enzimas, catalizadores biológicos que tienen la capacidad de disminuir la energía de activación (ver Cuaderno Nº 30, 34, 54, 73). Al disminuir la barrera entre sustratos y productos, la mayoría de las moléculas tienen energía suficiente para pasar sobre el estado de transición y por lo tanto aumenta la velocidad de la reacción.
Las enzimas sólo aceleran reacciones posibles, es decir, reacciones que ocurrirían aún en su ausencia pero a velocidades imperceptibles. Las reacciones que ocurren en las células son definidas por la presencia de las enzimas que las catalizan. Es por ello, que el metabolismo celular está organizado por enzimas.
Tal como se muestra en la figura 1, el metabolismo es una ordenada serie de cadenas o redes de reacciones en la que los metabolitos son compartidos por diferentes rutas, es decir, el producto de una reacción es el sustrato de la próxima. Las rutas lineales (ver figura 4) de sucesivas reacciones están conectadas con otras y de esta forma, las células pueden sobrevivir, crecer y reproducirse.

Fig 4. Grupo de reacciones catalizadas que conforman una ruta metabólica, en la que la molécula”A” finalmente se convierte en la molécula “D”.

Fuente: ArgenBio

Hasta en la célula más simple se llevan a cabo miles y miles de reacciones, sumamente ordenadas y que en conjunto están reguladas rigurosamente. Es cierto que las enzimas son las que organizan el metabolismo, pero ellas también reciben “órdenes”. Su actividad catalítica es modificada en función de las necesidades metabólicas de la célula. La regulación enzimática es un asunto complejo, pero básicamente el metabolismo se regula mediante:

a) La cantidad de enzima presente en la célula.
b) La actividad catalítica de las enzimas.
c) La disponibilidad de sustratos.

Una de las formas más comunes de regulación es la retroinhibición o feedback negativo, en la que uno de los productos finales inhibe la actividad catalítica de alguna de las enzimas del principio de la ruta metabólica. Por ejemplo, en la figura 4, el producto “D” inhibiría a la enzima 1, y toda la ruta metabólica se interrumpiría.
Por ejemplo la glucólisis es la puerta de entrada a la respiración celular, es decir, a la oxidación de azucares que permitirán la liberación de energía. Esta ruta es regulada negativamente por el ATP, que en última instancia es el producto principal de la respiración celular. Al haber mucho ATP se inhibe la ruta metabólica que lleva a su fabricación.

Reacciones redox (reducción- oxidación)

Las pilas que utilizamos en juguetes, controles remotos o relojes les proveen de la energía necesaria para hacer un trabajo. En la pila hay dos componentes químicos con diferente afinidad por los electrones, por lo que se establece un flujo de electrones espontáneo que finalmente produce energía eléctrica. En la pila está ocurriendo una reacción redox o de oxido-reducción que consiste en la transferencia de electrones desde un dador (agente reductor) a un aceptor (agente oxidante). Un ejemplo de reacción redox es la oxidación del ion ferroso por el ion cúprico:

Fe2+ + Cu2+ D Fe3+ + Cu+

En este caso, el catión ferroso (Fe2+) se oxida mientras que el ion cúprico (Cu2+) gana electrones, y se reduce. La oxidación y la reducción deben ocurrir simultáneamente, es decir, para que una sustancia se oxide (pierda electrones) es necesario que esté en contacto con otra que se reduzca (gane electrones).
En sistemas biológicos las reacciones redox son fundamentales, al punto que el uso e intercambio de energía en el metabolismo es regido por reacciones de oxidación y reducción.
La glucosa, por ejemplo, es un intermediario clave de varias rutas metabólicas. En función del nivel energético, la glucosa presenta distintos destinos. Si la carga de energía celular es baja, entonces sufrirá una serie de reacciones de oxidación con la concomitante liberación de energía. Por el contario, si la célula no precisa energía, la glucosa se almacena luego de ser polimerizada en forma de glucógeno o almidón (según el tipo de organismo), con absorción de energía.
El flujo de electrones juega un rol central en la respiración celular y en la fotosíntesis. En la membrana interna mitocondrial y en la membrana tilacoidal de los cloroplastos existen cadenas transportadoras de electrones. Cada uno de los componentes de la cadena se van reduciendo y oxidando, de forma que el primero le cede electrones al segundo, éste al tercero, y así sucesivamente hasta un aceptor final que se reduce definitivamente. Con el transcurrir de los electrones por la cadena, se van liberando energía que se aprovecha para sintetizar ATP.

Moléculas transportadoras de electrones

En sistemas biológicos, la transferencia de electrones desde un dador a un aceptor implica la existencia de moléculas intermediarias dinámicas capaces de aceptar electrones y luego donarlos. Esos intermediarios se conocen como transportadores de electronesy pueden estar libres o asociados a enzimas de membranas. Entre los que difunden libremente se encuentran el NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) y el NADP+ (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato). A pesar de sus semejanzas estructurales y de afinidad por los electrones, el NAD+/NADH está involucrado en reacciones catabólicas, mientras que el NADP+/NADPH está implicado principalmente en vías anabólicas. En la siguiente ecuación se muestra la reacción de reducción del NAD+.

Fig 5. Reducción del NAD+ y NAD+P. El anillo nicotinamida acepta dos electrones y un protón. Otros transportadores de electrones son el FAD+, la ubiquinona y el grupo Hemo.
Fuente: Molecular Biology of the Cell. Alberts,et al. Fourth edition

Energía a partir de los alimentos

Los alimentos que ingerimos están compuestos por proteínas, hidratos de carbono, y lípidos, entre otros componentes. La primera instancia en la obtención de energía a partir de esas biomoleculas, consiste en su degradación hasta los monómeros que las constituyen. De esta forma se producen aminoácidos, azucares simples, glicerol y ácidos grasos. Estos monómeros, a su vez, sufren reacciones de oxidación que dan origen a un acotado grupo de moléculas que luego convergen en la formación de AcetilcoA. Esta molécula aporta dos carbonos que ingresan en el ciclo de Krebs, se oxidan hasta CO2 generando poder reductor (NADH y FADH2). Finalmente, estos transportadores reducidos, ceden sus electrones a la cadena de transporte de electrones de la membrana interna mitocondrial. A medida que los electrones fluyen de una molécula en otra hasta el 02, se sintetiza ATP por el proceso fosforilación oxidativa. En resumen, como parte del catabolismo celular los alimentos son oxidados hasta CO2, con obtención de agua, de energía y consumo de O2.

Producción de alimentos con el aporte de energía

Los organismos autótrofos pueden sintetizar todo su material celular a partir de sustancias simples como única fuente de carbono. Para ello deben obtener energía del entorno en forma de luz o energía química.
La fotosíntesis es un proceso anabólico, por el que se sintetiza materia orgánica (azucares) a partir de CO2, agua y sales minerales. La energía lumínica absorbida se convierte en energía química, contenida en las moléculas orgánicas fabricadas. Como subproducto del proceso de fotosíntesis se libera O2 al entorno.

Producción de alimentos con el aporte de energía

La ingeniería metabólica consiste en la aplicación de técnicas de ingeniería genética para la modificación de las vías metabólicas presentes en un organismo.
A partir de la siguiente ruta metabólica hipotética, es posible:

Fig 6. Ruta metabólica hipotética

Fuente: ArgenBio

Aumentar la expresión de enzimas para obtener grandes cantidades de algún compuesto de interés. La sobreexpresión de la enzima 1, se traduciría en un mayor flujo metabólico y por ende en mayor producción de los compuestos “F” y “G”. Por ejemplo: Sobreexpresión de antibióticos en bacterias (ver cuaderno nº 51).
Completar rutas metabólicas mediante la inserción de genes heterólogos. Al introducir la enzima 7 (de otro organismo), se puede sintetizar en el organismo receptor una molécula de interés. Por ejemplo: el Arroz dorado (ver cuaderno nº 23).
Bloquear o disminuir la expresión de rutas normales. El bloqueo de la expresión de la enzima 6 inhibiría la síntesis del compuesto “G”. Por ejemplo: Desarrollo de plantas de café con bajo nivel de cafeína (ver cuaderno nº 8).
Bloquear rutas alternativas. Si se eliminara la expresión de la enzima 3, el compuesto “C” se direccionaría en su totalidad hacia la síntesis de los metabolitos “E” y” G”. Por ejemplo: Sobreproducción de diacetilo, metabolito que confiere sabor a manteca, en bacterias lácticas por el bloqueo de la síntesis de piruvato.
Modificar la regulación de rutas normales. Suponiendo que la enzima 4 es inhibida por el compuesto”G” sería posible introducir en el organismo una variante de la enzima insensible a la regulación negativa. Por ejemplo: Producción del aminoácido lisina en Corynebacterium glutamicum.
La tecnología del ADN recombinante dispone de varias estrategias para modificar rutas metabólicas, y lograr el mejoramiento de cultivos, de alimentos, la producción de medicamentos, etc.

Actividades

ADN como portador de información

2008-07-25T15:43:00.007-03:00

El ADN es el encargado de almacenar y transmitir con gran exactitud las instrucciones necesarias para que cada célula sea lo que es a través de la acción de las proteínas.

Aquí nos encontramos con dos cuestiones por resolver:

• El ADN es un polímero formado por cuatro clases de nucleótidos y las proteínas son polímeros constituidos por veinte clases de aminoácidos. Tenemos pues dos lenguajes diferentes, uno para almacenar la información y otro para ejecutarla.
• Todo este cúmulo de información tiene que poder pasar de generación en generación, de la célula madre a las hijas de forma tal que los nuevos individuos tengan toda la información necesaria para poder vivir.

El primer planteo nos hace pensar que las células tienen que tener algún tipo de mecanismo que les permita traducir los datos del ADN, de manera que si por ejemplo las instrucciones dicen “hacer hemoglobina” la célula sepa hacerla, por lo tanto debe de existir un código genético.
El segundo problema se resuelve gracias a que las células tienen un complejo mecanismo enzimático para replicar su material genético, de manera tal que cada célula hija reciba de la progenitora un juego completo de información necesaria para vivir.
Es evidente que dichas instrucciones, almacenadas en el ADN, tienen que permanecer en su mayoría constantes a lo largo de las generaciones. Sin embargo, esta macromolécula sufre a veces cambios en su información llamadas mutaciones, que muchas veces resultan ventajosas ya que permiten que un organismo pueda modificarse gradualmente con el fin de adaptarse mejor a los posibles cambios del medio en que vive.
Trataremos de comprender cómo ocurre este flujo de información desde el ADN a las proteínas y cómo los cambios en dichas instrucciones son la base fundamental de la Evolución.

Regulación de la expresión genéticaLa molécula de ADN contiene toda la información necesaria para que la célula sintetice todos los tipos de proteínas que necesite durante su vida. Muchas de estas proteínas estarán siempre presentes, mientras que otras sólo se sintetizan en un determinado momento de la vida celular. Además, si nos referimos específicamente a los organismos eucariotas pluricelulares, vemos que sus células, en la mayoría de los casos, alcanzan un alto grado de diferenciación debido a que expresan selectivamente ciertos genes de proteínas específicas; pese a que todas las células contienen la información genética completa.

Cuando se analizó la composición química del cromosoma eucariota se encontró que estaba formado por ADN y proteínas en partes iguales. Se trató, entonces, de saber cuál de estas dos moléculas contenía la información genética. Las proteínas parecían ser los candidatos más adecuados para esta función, debido a su abundancia y diversidad de funciones en todas las células.
Algunos experimentos dieron la respuesta a este interrogante.

Experimento de Griffith (1928):
Griffith trabajó con neumococos (bacterias causantes de neumonía). Disponía de dos cepas: una encapsulada que era virulenta y la otra no encapsulada no virulenta. Inyectó estas dos cepas en ratones.

El factor de transformación.
Ya en esos años, entre los científicos estaban planteadas algunas preguntas: ¿qué sustancia era la encargada de transmitir ciertos caracteres? ¿Cuál era la composición química de los genes?
La respuesta la trajo el estudio de una enfermedad infecciosa mortal: la neumonía. Durante la década de 1920, el médico inglés Frederick Griffith estudió las diferencias entre una cepa de la bacteria Streptococcus peumoniae que producía la enfermedad y otra que no la causaba. La cepa que causaba la enfermedad estaba rodeada de una cápsula de polisacáridos que le daba a las colonias de estas bacterias en las placas de Petri un aspecto liso o suave, por lo cual se las denominó cepa S (smooth, en inglés). La otra cepa no tiene cápsula y no causa neumonía y se la denomina cepa R (rugosa) también por el aspecto de la colonia.
La siguiente ilustración representa la experiencia realizada por Griffith, y los resultados que obtuvo:

El material hereditario

Si bien al período entre 1900 y 1940 se lo consideraba la edad de oro de la genética, hasta ese momento, los científicos creían que el material hereditario eran las proteínas.

En 1952 Alfred D. Hershey y Martha Chase realizaron una serie de experimentos destinados a dilucidar si el ADN o las proteínas eran el material hereditario.

Trabajaron con bacteriófagos o fagos, que son virus que infectan bacterias. Debido a que los fagos están compuestos sólo por una cabeza proteica que guarda en su interior ADN, eran la herramienta ideal para resolver la naturaleza del material hereditario.

Figura: Los bacteriófagos son un tipo de virus que atacan a las bacterias. Están constituidos por ADN y una cubierta de proteínas. En la actualidad se sabe que los bacteriófagos infectan una célula inyectándole su ADN, el cual "desaparece" mientras toma control de la maquinaria de la bacteria que comienza a fabricar nuevos virus.

Fuente: http://www.biologia.edu.ar/adn/adntema0.htm

Su experimento consistió en marcar el ADN y las proteínas, con alguna sustancia que los hiciera visibles, como los isótopos radioactivos, esto permitiría ver cuál de ellos entraba en la bacteria. Ese sería el factor transformador de Griffith.

Dado que el ADN contiene fósforo (P) en su grupo fosfato pero no azufre (S), ellos marcaron el ADN con Fósforo-32 radioactivo. Por otra parte, las proteínas no contienen P pero si S, y por lo tanto se marcaron con Azufre-35 radioactivo.

Hershey y Chase encontraron que el S-35 quedaba fuera de la célula mientras que el P-32 se lo encontraba en el interior. Por lo tanto, dedujeron que durante la infección el ADN del fago entra en la bacteria, dejando afuera la cabeza proteica. Es decir que el ADN lleva la información para hacer más fagos hijos dentro de la bacteria. En otras palabras, el experimento indicaba que era el ADN el portador de la información genética del fago.

Esta conclusión coincidía con la obtenida por Avery, MacLeod y McCarty, que indicaba que el ADN era el material genético de las bacterias. Sin embargo, fue el experimento de los fagos el que disipó las dudas sobre la composición química de los genes: eran parte del ADN y, por lo tanto, estaban integrados por los cuatro tipos de nucleótidos.

Las reglas de Chargaff

Como se mencionó anteriormente, para esa época prevalecía la idea de que el ADN era una molécula demasiado simple como para ser considerada portadora de la información genética. Esta idea fue desechada en 1950 por el científico checo Erwin Chargaff del Instituto Rockefeller, quien analizó en detalle la composición de bases del ADN extraído de diferentes organismos. Llegó a la sorprendente conclusión de que las cuatro bases nitrogenadas no se encontraban en proporciones exactamente iguales en las distintas especies, lo cual sugirió que el ADN no debía ser tan monótono como se pensaba.

Chargaff demostró que, independientemente del origen del ADN, la proporción de purinas era igual a la de pirimidinas. Es decir, adenina (A) aparecía con tanta frecuencia como la timina (T) y la guanina (G), con tanta frecuencia como la citosina (C). Había dos juegos de equivalencias, A y T por un lado y G y C por otro.

Este resultado reflejaba por primera vez un aspecto estructural del ADN. Indicaba que, independientemente de la composición de A o de G en un ADN, siempre la concentración de A es igual a la de T y la de C igual a la de G. Sin embargo, en aquel momento Chargaff no sospechó las implicancias que podían tener estas reglas, denominadas más tarde “reglas de Chargaff”, en el esclarecimiento de la estructura del ADN.

1.- ¿Cuál fue la conclusión a la que llegó el investigador Frederick Griffith en 1928 a partir de sus experiencias con ratones?
2.- Explicar cuál fue el experimento que permitió disipar las dudas acerca de la naturaleza del material genético, es decir que era el ADN y no las proteínas.
3.- ¿Qué dato aportaban las denominadas “reglas de Chargaff” acerca de la composición química del ADN?

Actividad del C02

2008-05-14T16:05:00.008-03:00

Análisis de un artículo periodístico

Artículo publicado en el diario Clarín el 14 de febrero de 2003, al cumplirse 50 años del descubrimiento de la estructura del ADN:

http://www.clarin.com/diario/2003/02/14/s-04201.htm
Preguntas para analizar el artículo:

a)¿Cuál es el hecho científico – histórico que rememora este artículo periodístico? ¿En qué año ocurrió?

b)¿Cuáles son los hechos de “intriga y egoísmo” a que hace referencia el artículo?
c)Si antes de 1953 ya se conocía que el ADN era el portador de la información genética, ¿cuál fue el aporte del descubrimiento de la estructura del ADN?

d)¿Qué relación hay entre este descubrimiento y la teoría de la evolución a partir de un antepasado común desarrollada por Charles Darwin? Relacionar con la frase del artículo “Confirmó que bacterias, plantas, hongos y animales somos parientes”, y con el concepto de “código genético universal”.
e)¿Qué técnicas o investigaciones en la actualidad pueden desarrollarse gracias al conocimiento de la estructura y función del ADN, según este artículo?
f)El artículo menciona que el descubrimiento “posibilitó el desarrollo de poderosas biotecnologías que revolucionaron a la producción agropecuaria y a las industrias farmacéuticas y de la alimentación”. ¿A qué se refiere? Dar algunos ejemplos.

MATERIAL DE CONSULTA

1. El ADN como material genético (un poco de historia). http://www.argenbio.org/h/biotecnologia/03.php

2. ADN y síntesis proteica. Hipertextos del Área de la Biología. Univ. Nacional del Nordeste.
http://www.efn.uncor.edu/dep/biologia/intrbiol/indadn.htm

3. Hipertextos del área de la biología. Univ. Nacional del Nordeste. Fac. de Agroindustrias, Saenz Peña, Chaco • Fac. Ciencias Agrarias, Corrientes. República Argentina.
http://www.biologia.edu.ar/adn/

Actividades del C01

2008-03-19T14:24:00.004-03:00

A partir del esquema determinar:

a) ¿qué representan las ilustraciones?

b) ¿qué instrumento se emplearía para observar las diferentes estructuras representadas en el esquema?

c) Dada la siguiente lista de ejemplares, determinar qué tipo de microscopía (óptica o electrónica) sería la más adecuada para analizarlos: 1) célula animal – 2) virus - 3) bacteria – 4) proteínas – 5) mitocondrias – 6) óvulo – 7) neuronas – 8) piojo – 9) sacarosa (azúcar de mesa) – 10) ADN

e) En la foto se muestra una célula vista al microscopio electrónico de transmisión (MET)

I) Indicar si la célula de la foto es eucariota o procariota. Justificar la respuesta.

II) Indicar si la célula de la foto es animal o vegetal Justificar.

III) Indicar el nombre de las estructuras señaladas.
1 -----------------------------------------------------------
2 ----------------------------------------------------------
3 ----------------------------------------------------------
4 ----------------------------------------------------------

f. Una cuestión de tamaños
Objetivo: trabajar las dimensiones relativas de componentes microscópicos.

a) ¿Cuántas células de 1 micrómetro (μm) entrarían en la cabeza de un alfiler?

b) ¿Cuántos glóbulos rojos hay en una gotita de sangre (1 mm3)?

Bienvenidos al ciclo 2008

2008-02-14T20:13:00.004-02:00

En esta entrada corresponden las palabras de bienvenida y la explicación de como acceder a los cuadernos teóricos (C) y a las actividades de cada uno de los cuadernos (del C) en la columna de la derecha.

Cuaderno 08

2008-02-12T21:18:00.000-02:00

Habitualmente, se considera la clonación una técnica nueva debido, fundamentalmente, a la gran difusión que recibió en los medios de comunicación la clonación de la oveja Dolly. Es interesante interpretar la clonación de plantas como un procedimiento antiguo y, a su vez, plantear las diferencias que presenta con la clonación de animales cuyas células difieren en cuanto a su totipotencialidad. Es interesante trabajar las implicancias que tuvo la clonación de Dolly en cuanto a los conocimientos acerca del ADN y su función. La clonación de mamíferos replanteó algunas teorías existentes acerca del ADN, que plantean que las células adultas de mamíferos perdían su totipotencialidad, debido a la inactivación de segmentos de ADN. Esto determinaba que no pudieran diferenciarse y dar origen a un organismo completo. Sin embargo, y a pesar de las dificultades que sufrió Dolly, esta oveja clonada se originó a partir del ADN extraído de células adultas. A partir de esta experiencia, los desarrollos se fueron mejorando y actualmente se obtienen terneros clonados y transgénicos a partir de células fetales totipotentes.
Desde el punto de vista conceptual, es importante diferenciar la clonación como duplicación de un organismo y la clonación terapéutica, que permite el cultivo de tejidos de un organismo para ser aplicado en la regeneración o reemplazo de tejidos dañados y, consecuentemente al tratamiento o cura de enfermedades. Esta diferenciación es importante ya que la clonación involucra aspectos éticos cuya discusión requiere tener claros estos conceptos. De lo contrario, se puede incurrir en interpretaciones erróneas o en desconocimiento, que interfiera con los avances científicos y tecnológicos que podrían beneficiar a la sociedad.

Biotecnología moderna en animales

Los animales transgénicos
A diferencia de la biotecnología vegetal y de los microorganismos recombinantes (transgénicos) que ya se aplican a algunos sectores de la producción, los beneficios que puede ofrecer la modificación de animales a través de la ingeniería genética está en sus comienzos. Sin embargo, ya existen desarrollos importantes en marcha, y la Argentina es uno de los países que lidera en este sector. Concretamente, la empresa argentina Biosidus ha obtenido en 2002 terneros transgénicos que producen en su leche la hormona de crecimiento humana que se aplicaría para tratar patologías del crecimiento en los niños.
Por otra parte, recientemente se ha publicado el primer caso de vacunos modificados genéticamente para mejorar su calidad, y no para producir fármacos. Ocurrió en Nueva Zelanda donde se logró la creación de vacas transgénicas que producen leche con alto contenido de proteínas, destinada a la fabricación de quesos.
Pero... ¿qué es un animal transgénico? Es un animal genéticamente modificado al que le transfieren un gen o grupo de genes con el fin de obtener un producto de interés.

Algo de historia...
Los ratones fueron los primeros animales transgénicos, y se obtuvieron en la década de 1980, paralelamente con el advenimiento de la ingeniería genética. El primer ratón transgénico, producto de una investigación publicada en la prestigiosa revista científica Nature en 1982, producía la hormona de crecimiento de rata. Esto hacía que el ratón transgénico produjera mucha más hormona de crecimiento que el ratón “silvestre”, por lo cual se veía bastante más grande que él.
Este experimento constituyó una revolución porque mostraba que un gen de una especie podía introducirse en otra especie diferente, integrarse al genoma del receptor, y expresarse (la proteína se fabrica y el organismo manifiesta la característica asociada).
Desde ese momento los ratones transgénicos constituyeron una herramienta fundamental en el laboratorio para el estudio de la fisiología animal y sirvieron de modelos experimentales para entender las bases de muchas enfermedades que afectan al hombre.
Más adelante, crearon el primer ratón knockout (KO), esto significa que se le anula la actividad de un gen para analizar los efectos producidos. Esta técnica resultó clave para estudiar la función de los genes.

Los ratones transgénicos se obtienen por:

1. microinyección del ADN en el óvulo fecundado: el ADN se introduce por medio de un capilar, bajo el microscopio, en el ovocito fecundado. Esto se debe hacer muchas veces porque en ocasiones los ovocitos o los núcleos se rompen y los óvulos transformados resultan escasos.

2. microinyección del ADN en células embrionarias: el organismo adulto será una quimera ya que no todas las células incorporan el nuevo gen. Entonces, se utilizarán solo los animales que tengan el gen en sus gametas y por lo tanto lo transmitan a su descendencia. Esta técnica es más fácil y eficiente que la anterior a pesar de que se descarten animales.

Microinyección de ovocitos fecundados
El gen que se inserta está dentro del plásmido de una bacteria E. Coli. Se introduce todo el plásmido (con el gen de interés y con otras secuencias del plásmido) y una vez dentro del núcleo de la célula el ADN se integra al material genético del animal.

Los ratones transgénicos se utilizan fundamentalmente:

Como herramientas de laboratorio para estudiar los genes, su función, y cómo se regula su expresión si se cambia el lugar o el tiempo de expresión de ese gen. Por ejemplo, se puede hacer que la proteína se manifieste en todos los tejidos, o que se exprese en adultos en lugar del organismo recién nacido.

Como modelos de enfermedades para el desarrollo de drogas y estrategias de tratamiento.

Otros animales transgénicos
Hoy es posible obtener animales transgénicos grandes, como ovejas, cabras, cerdos y vacas. Esto se debe en parte al desarrollo de las técnicas de clonación. La ingeniería genética permite modificar genéticamente animales, con diferentes aplicaciones:

ayudar a los investigadores a identificar, aislar y caracterizar los genes y así entender cómo funcionan.

servir como modelos de enfermedades que afectan al hombre y así poder desarrollar nuevas drogas y nuevas estrategias de tratamiento.

como fuente de tejidos y órganos para transplantes en humanos.

para mejoramiento del ganado y otros animales de importancia económica.

para producir leche con mayor valor nutricional o que contenga proteínas de importancia farmacéutica (que se purifican de la leche en grandes cantidades).

Tracy fue la primera oveja transgénica, antes de la “famosa” Dolly, y vivió entre 1991 y 1998. Producía 40 g/l de alfa-1-antitripsina (un fármaco) en la leche. Fue hecha transgénica por la técnica de microinyección.
Dolly fue la primera oveja obtenida por clonación a partir de células somáticas. Fue una revolución porque sentó las bases para crear posteriormente animales transgénicos grandes, y desde el punto de vista de la biología se conseguía hacer por primera vez lo que se puede hacer con una planta, es decir regenerar todo el organismo a partir de una célula somática adulta (de la ubre). Dolly vivió entre 1997 y 2003, y murió con muchas complicaciones propias de un individuo de más edad ya que sus células derivan de una célula original adulta.

La modificación genética de animales

El genoma de los animales se puede modificar:

Insertando genes de la misma especie o de una especie diferente (por ejemplo para que una vaca produzca en su leche la hormona de crecimiento humana).

Alterando ciertos genes presentes en el animal de manera que esta modificación se transmita a la descendencia. En general esta estrategia está relacionada con conocer la función de ese gen.

Clonación de animales

La oveja adulta A dona una célula somática (de la ubre). La oveja adulta donante aporta un óvulo no fecundado al cual se le extrae el núcleo para sacar su información genética, que se va a reemplazar por el núcleo de la célula somática de A. Se fusiona la célula de la oveja A y el óvulo no fecundado que tiene la potencialidad del óvulo, con la información genética diploide (2n) de la oveja adulta. Esta célula, in vitro, origina un embrión para que después se implante en una oveja nodriza que es diferente a la oveja donante y a la oveja A. La oveja nodriza aporta el útero. Al cabo de un tiempo nace el animal clonado que es genéticamente idéntico al animal A.

La producción de determinadas proteínas en la leche de animales transgénicos es particularmente interesante cuando esas proteínas se requieren en gran cantidad o son muy complejas. La producción en leche permite, además, una purificación relativamente simple de la proteína de interés. Como la producción de la nueva molécula no debe interferir con el crecimiento y metabolismo del animal, se introduce el gen de interés junto con una secuencia (promotor) que permite su expresión únicamente en la glándula mamaria. De esta forma se consiguió la expresión de genes que producen sustancias con función farmacológica en glándulas mamarias de ovejas, de cabras y de vacas.

La primera ternera transgénica desarrollada por clonación fue obtenida por BioSidus en Argentina, y produce la hormona de crecimiento humana en su leche.
Mansa es una ternera argentina que nació en 2002. Fue la primera ternera clonada y transgénica, y pertenece a una serie de experimentos que realiza la empresa Bio Sidus. Esta investigación empezó con el nacimiento de Pampa en 2001, la primera ternera clonada del mundo (no transgénica) que demuestra que las vacas se pueden clonar y se pueden hacer transgénicas. Pampa se hizo con una técnica similar a Dolly pero en lugar de células de la ubre se utilizaron células fetales. Luego llegó Pampa Mansa y sus hermanas que, además, son transgénicas.

Obtención de animales transgénicos

Ver infografía en el siguiente link:
http://www.lanacion.com.ar/Archivo/Nota.asp?nota_id=532215

Mansa se obtuvo a partir de células de un feto de la raza lechera Jersey, de las que se extrajeron células de tipo fibroblasto, que forma parte del tejido conectivo. A los fibroblastos se les incorporó el gen que codifica para una proteína que es la hormona de crecimiento humana (el plásmido transformado se incorpora al genoma). El óvulo, al que se le sacó el núcleo, fue aportado por una vaca de raza Aberdeen Angus. El óvulo y el fibroblasto se fusionaron y de esta forma se obtuvieron células con la información genética de una célula fetal pero con el agregado del gen para la hormona de crecimiento humana. Estas células se cultivaronn in vitro y el embrión resultante se implantó en el útero de una vaca nodriza Aberdeen Angus. Luego de 278 días nació Mansa que produce la hormona de crecimiento humana en su leche.

Una vez que se tiene el animal transgénico, es posible obtener otros idénticos a partir de la clonación. De esta forma se puede conservar y multiplicar alguna característica beneficiosa. La clonación permite, además, recuperar animales en extinción para proteger la especie, obtener tejidos y órganos para transplantes y también stem cells (“células madre”) que son células embrionarias totipotentes que sirven para generar diferentes tejidos. Estas células se pueden transformar y emplear con fines terapéuticos en determinadas enfermedades y en transplantes.
En los próximos años se esperan avances en estos desarrollos biotecnológicos. En Argentina, ya se obtuvieron descendientes de Mansa, una dinastía de animales transgénicos que integran el “tambo farmacéutico”.

Cuaderno 07

2008-02-12T20:28:00.000-02:00

Un modelo puede ser también el prototipo de una clase al que se hace referencia para reconocer rasgos similares en objetos, hechos, procesos o situaciones con el objetivo de agruparlos en la clase identificada por el prototipo. Este significado que se atribuye a un “modelo” se asociaría con el de “especies modelo” al que hace referencia el Cuaderno. La importancia de las especies modelo es entendida a la luz de la evolución, dado que por el origen común, el conocimiento obtenido en un organismo tan simple como un gusano puede extrapolarse al hombre, justamente porque genes similares han sido conservados en las distintas especies a lo largo de la evolución.

LAS ESPECIES MODELO EN BIOTECNOLOGIA

¿Qué es una especie modelo?
“¿Cómo puede un gusano ser tan importante para la humanidad?”, preguntó el periodista.
“La palabra clave es ‘evolución’; toda la vida viene de un ancestro común. Entonces, no es sorprendente encontrar que la maquinaria de la vida es similar entre un ser y otro. Así que cuando miramos al gusano, sabemos que sus piezas de maquinaria biológica son similares a las nuestras” - respondió el investigador John Sulston, premio Nobel de Medicina y Fisiología 2002.
El párrafo anterior, extraído de una nota publicada recientemente en el diario La Nación, resume en pocas palabras la base sobre la cual se sustenta el concepto de “especie modelo”. Las especies modelo, entre ellas el gusano, son una herramienta fundamental en algunas áreas de la investigación científica, ya que permiten realizar estudios sobre determinados caracteres y los resultados pueden ser extrapolados a otras especies. De esta forma, a partir de unas pocas especies es posible ampliar el conocimiento acerca de la enorme variedad de seres vivos existentes en la naturaleza.
Las especies que se eligen como modelo tienen las siguientes características en común:

Fácil manutención y manipulación en el laboratorio;
Ciclos de vida cortos;
Gran número de descendencia;
Disponibilidad de variabilidad fenotípica y genotípica;
Fenotipo de interés sencillo de observar o medir;
Técnicas de estudio puestas a punto para estas especies.

Por ejemplo, la especie de arvejas Pisum sativum resultó ser un excelente modelo para estudiar las leyes básicas de la herencia, mientras que la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) resulta un modelo adecuado al estudiar la función de los cromosomas sexuales en los animales.

Las especies modelo en la biotecnología
En los últimos años, con el advenimiento de la “Era Genómica”, se pudo conocer el genoma de las especies modelo. Esto aporta una nueva característica de estudio que es de especial interés para la biotecnología y la biología molecular. Por ejemplo, a partir del estudio del genoma de estas especies es posible conocer las variantes génicas responsables de la diversidad dentro de la especie, o contar con técnicas de transformación genética que permitan obtener organismos transgénicos para su estudio.

A continuación se describen algunas especies modelo empleadas en biotecnología y biología molecular, y algunos de sus campos de aplicación:

Reino Monera
Especie modelo: Eubacteria Escherichia coli
Función / Campo de aplicación:
-Biología Molecular básica (ej.: regulación de la expresión génica en procariontes)
- Herramienta en Ingeniería Genética
- Biotecnología de ADN recombinante
- Producción de proteínas recombinantes a escala industrial
Archaebacteria
Especie modelo: Methanococcus, Thermophilus
Función / Campo de aplicación:
- Adaptaciones a hábitats inhóspitos
- Enzimas de interés industrial
- Metabolismos especiales
Reino Fungi
Especie modelo: Levadura Saccharomyces cerevisiae
Función / Campo de aplicación:
- Biotecnología de alimentos
- Genética Molecular
- Caracterización de genes
- Interacción de proteínas
- Producción de proteínas recombinantes a escala industrial.
Reino Animalia
Especie modelo: Gusano redondo Caenorhabditis elegans
Función / Campo de aplicación:
- Parasitología
- Biología del desarrollo
- Biología Celular
- Genética Molecular eucariota
- Evolución
- Neurobiología
Especie modelo: Mosca de la fruta Drosophila melanogaster
Función / Campo de aplicación:
- Genética eucariota
- Bases cromosómicas de la determinación del sexo
- Procesos celulares
- Desarrollo de los segmentos del cuerpo
- Desarrollo del sistema nervioso
- Comportamiento
- Control del sueño (ciclo circadiano)
- Evolución
- Medicina, Enfermedades
- Respuesta fisiológica a drogas
Especie modelo: Ratón Mus musculus
Función / Campo de aplicación:
- Medicina: enfermedades y tratamientos (vacunas),
y respuesta fisiológica a drogas y a alimentos
- Genómica funcional de mamíferos
- Comportamiento cromosómico en mamíferos
- Transgénesis en animales superiores (bovinos, caprinos)
- Comportamiento
- Control del sueño (ciclo circadiano)

Reino Plantae
Especie modelo: Arabidopsis thaliana
Función / Campo de aplicación:
- Genética de plantas
- Genómica funcional vegetal
- Ensayos de transgénicos
- Evolución
- Interacción planta-patógeno
- Interacción planta-entorno
Especie modelo: Nicotiana tabacum
Función / Campo de aplicación:
- Estudio de dicotiledóneas agronómicas
- Transformación genética vegetal
- Expresión de proteínas recombinantes

La clasificación "clásica" de los organismos comprende cinco reinos:

Monera,
Protista,
Fungi,
Plantae y
Animalia.

El conocimiento de los genomas y los mecanismos de expresión de los genes han llevado a muchos científicos a proponer un sistema diferente de clasificación cada vez más aceptado, compuesto por tres grandes dominios:

BACTERIA O EUBACTERIA comprende a bacterias modernas, como E. Coli;
ARCHEA O ARQUEOBACTERIAS que incluye bacterias primitivas, entre ellas las "extremófilas", por ejemplo Metanococcus sp; y
EUKARYA que incluye a los eucariontes (protozoos, hongos, plantas y animales).

Es decir que según la evidencia presentada por la biología molecular los primitivos procariotas se habrían separado en dos grupos muy temprano en el desarrollo de la vida en la tierra: Eubacterias y Arqueobacterias.

Características de las especies modelo
Procariontes

Escherichia coli es un tipo de bacteria que ha sido utilizada durante décadas como organismo modelo y, con el surgimiento de la ingeniería genética, pasó a ser el “organismo estrella” de la disciplina del ADN recombinante. Esto se debe a que las técnicas de transformación bacteriana son sencillas y fueron las primeras en desarrollarse rutinariamente en laboratorios de todo el mundo dado que no requieren de equipamiento sofisticado. E. coli se utiliza, entre otras aplicaciones, para obtener muchas copias de un fragmento de ADN de interés (amplificación), y para la fabricación de proteínas recombinantes a gran escala, por ejemplo la insulina humana. Además, los plásmidos de este tipo de bacteria son importantes ya que contienen genes de interés biológico, como aquellos que determinan ventajas adaptativas (por ejemplo, resistencia a antibióticos) y son utilizados como vectores de clonado y de expresión en ingeniería genética.

Microfotografía de Escherichia coli (microscopía electrónica de barrido). Fuente: http://ecmc2.sdsc.edu/. E. coli Model Cell Consortium, U.S.

Eucariontes

Saccharomyces cerevisiae es una especie modelo perteneciente a los hongos unicelulares. Este organismo ha sido parte de la biotecnología desde los comienzos de la historia ya que es la levadura utilizada en la elaboración del pan, el vino y la cerveza, entre otros productos obtenidos por fermentación.
La levadura Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo eucarionte ideal para estudios biológicos y genómicos, y ha resultado una herramienta poderosa para el entendimiento de los genes de organismos eucariontes superiores, como el humano, así como para un análisis sistemático de la función de los productos correspondientes a estos genes. La simplicidad de manipulación genética de la levadura permite que sea utilizada convenientemente para analizar la función de los productos génicos de organismos eucariontes superiores. En cuanto a su utilización biotecnológica como fábrica de moléculas recombinantes, la levadura es de gran utilización para la preparación de proteínas recombinantes de uso comercial. La importancia de esta levadura para la producción de productos proteicos por metodología de ADN recombinante queda ilustrada por el hecho de que la primera vacuna recombinante para humanos aprobada, contra la hepatitis B, y el primer producto alimenticio recombinante aprobado, la renina utilizada en la fabricación de queso, fueron producidos en sistemas de levaduras.

Microfotografía de levaduras.
Fuente: http://www.arches.uga.edu/~sashford/Microbes.html

Caenorhabditis elegans es un nematodo (gusano redondo) perteneciente a la categoría de los animales invertebrados. Los Nematodos son muy abundantes e incluyen importantes especies parásitas de plantas y animales. El estudio de esta especie aporta herramientas prácticas aplicables al tratamiento de enfermedades causadas por nematodos. Además, los conocimientos adquiridos acerca de este tipo de gusano permite compararlos con los de especies animales superiores. En particular, de Caenorhabditis elegans se conoce la descripción completa de su anatomía celular y la secuencia de su genoma. Las técnicas de ingeniería genética puestas a punto para esta especie permiten realizar investigaciones sobre diferenciación celular, neurobiología, desarrollo y evolución, mediante la comparación de los genomas de levaduras, gusanos y ratones, entre otros. Se ha identificado que el genoma de C. elegans determina características comunes a todos los animales (e incluso plantas) superiores. Por ejemplo, posee genes para la mayoría de los componentes moleculares del cerebro de los vertebrados, lo cual sugiere que esta especie provee un modelo válido para el estudio de sistema nervioso en animales.

Fotografía de C. elegans adultos(aprox. 1mm de longitud). http://nema.cap.ed.ac.uk/publications/science/C_elegans_is_a_nematode.html

Drosophila melanogaster es la pequeña mosca de la fruta, y pertenece al grupo de animales más abundante sobre la tierra: los artrópodos. Los estudios realizados en esta mosca durante los últimos cien años, han permitido comprender aspectos fundamentales de la genética eucariótica, entre ellos las bases de la determinación del sexo. La mayor parte del genoma de esta especie está secuenciado desde el año 2000. Los estudios realizados con genes de Drosophila han posibilitado armar modelos que explican muchos procesos celulares y de desarrollo embrionario en animales superiores. Se descubrió, por ejemplo, que los genes de mamíferos con similar secuencia a los de D. melanogaster también cumplen similares funciones. Algunos de ellos están relacionados con procesos complejos como el desarrollo del cuerpo y del sistema nervioso, el comportamiento, el control del sueño (ciclo circadiano), los procesos de neurodegeneración y respuestas fisiológicas a drogas tales como el alcohol. La conservación de genes y procesos biológicos entre mosca y mamíferos amplía el campo de influencia de este insecto a la medicina. El arsenal de técnicas genéticas disponibles en la mosca se aplica para caracterizar y comprender la función de genes humanos. Así se han podido detectar y conocer genes involucrados en la enfermedad de Parkinson, genes supresores de tumores, el homólogo a la insulina en mosca, como así también los algunos receptores de hormonas.

Mus musculus es un mamífero vertebrado, conocido corrientemente como ratón de laboratorio. El ratón ha sido elegido desde los comienzos de la investigación científica clínica como especie mamífero modelo dada su cercanía fisiológica y genética con el humano. Las pruebas de toxicidad de alimentos, medicamentos, y otras sustancias se han realizado tradicionalmente en el ratón de laboratorio y las conclusiones obtenidas de todos los ensayos son luego convenientemente extrapolados al hombre. El objetivo de los estudios con ratones es comprender los efectos que causan diferentes mutaciones y utilizar esos datos en la búsqueda de posibles equivalencias en la especie humana. Inicialmente los estudios se realizaron con mutantes naturales, pero luego se desarrollaron las técnicas de transformación, en las cuales el gen de interés del ratón es mutado al insertar intencionalmente en su secuencia algún transgén de modo tal de anular la expresión del gen endógeno. Así se han obtenido, por ejemplo, ratones que expresan los posibles genes de obesidad, y han resultado efectivamente más obesos y al anular su expresión y observar su falta de obesidad se pudo confirmar la función del gen humano, como así también la existencia de una homología para dicho gen entre humanos y ratones. Este ejemplo demuestra el potencial de estos modelos para determinar genes involucrados en enfermedades y las posibles implicancias en el campo de la medicina.

Arabidopsis thaliana es una hierba diminuta y una de las especies modelo, aunque sin valor comercial, ni relevancia ecológica. Dentro del Reino Planta el mayor interés está puesto en comprender la biología de las especies de importancia agronómica y poder mejorarlas para un mayor aprovechamiento. Elegida como especie modelo por su minúsculo tamaño, rapidez de reproducción, gran número de semillas por planta, genoma compacto y la facilidad de realizar cruces y transgénicos, Arabidopsis pasó en menos de 15 años de ser casi desconocida a ser la especie mejor entendida de todo el reino vegetal. Al analizar el genoma de esta planta, se encontró que se trata de un genoma muy pequeño pero con un gran número de genes y que un 8% concuerda con genes animales, sobre todo los vinculados con el metabolismo primario (síntesis de elementos básicos, como azúcares o lípidos). Arabidopsis comparte genes funcionales (germinación, floración, formación de semillas) con otras plantas como el arroz, la soja, el trigo, el maíz y el algodón. Al igual que la información obtenida de otros proyectos genoma, la información del genoma de Arabidopsis ayudará a comprender los mecanismos de la evolución. Además, el conocimiento de la genética molecular de esta especie ha facilitado el avance hacia el mejoramiento de otras especies vegetales de mayor importancia agronómica, por medio de la obtención de plantas transgénicas con genes de caracteres de interés provenientes de otras especies vegetales (ej: resistencia a estrés ambiental por frío, salinidad, etc). También permitió el avance en el conocimiento relacionado con el metabolismo secundario de las plantas, de gran aplicación industrial, farmacológica y cosmética, como así también en la obtención de tejidos derivados de fibras vegetales y en la producción de energía derivada de vegetales (biodiesel).

Planta transgénica de tabaco que expresa el gen de la luciferaza de la luciérnaga. Fuente. Science (1986) 234: 856-859
Nicotiana tabacum o planta de tabaco es utilizada experimentalmente como planta modelo para la transformación genética y cultivo in vitro por ser fácilmente transformable y tener una morfología y fisiología más semejante a la de cultivos agronómicos como el tomate y otras dicotiledóneas. Muchas proteínas recombinantes que se quieren expresar en plantas superiores, como así también las proteínas recombinantes de interés farmacológico (para obtener las llamadas plantas transgénicas de tercera generación, utilizadas como fábricas de moléculas) son primero ensayadas en tabaco.

Cuaderno 06

2008-02-12T19:35:00.000-02:00

Además de la comprensión de los conceptos vinculados con la ingeniería genética, resulta interesante trabajar en el aula la transgénesis animal para interpretar y destacar las ventajas que representan estos nuevos desarrollos biotecnológicos para la población.
Algunos de los aspectos que se pueden destacar: la importancia que representa para el desarrollo del país la interacción entre la actividad científica y la industrial; las ventajas de estas tecnologías desde el punto de vista de la producción (obtener una proteína completamente ajena al organismo, en grandes cantidades, fácil de purificar), y la ventaja que representa para la población la obtención de productos farmacológicos que podrían resultar más convenientes que los fármacos obtenidos por técnicas “tradicionales”. Por ejemplo, la producción en animales de los factores de coagulación de la sangre a partir de genes humanos, que se emplea para el tratamiento de hemofílicos , evitaría extraerlo de sangre humana, y se reducirían de esta forma los riesgos asociados a la transmisión de enfermedades.

ANIMALES COMO FÁBRICAS DE MOLÉCULAS

Los animales transgénicos
La ingeniería genética permite modificar genéticamente animales. Los primeros animales modificados genéticamente, o transgénicos, se obtuvieron como resultado de experimentos realizados en la década de 1980. Entre ellos, se logró obtener ratones mucho más grandes que su tamaño normal, que resultaron de la introducción del gen que codifica para la hormona de crecimiento de rata. Esta experiencia demostraba que un gen podía transferirse de una especie a otra diferente, integrarse a su genoma, ser funcional y transmitirse a la descendencia.
La modificación genética se realiza de dos maneras: alterando ciertos genes presentes en un animal de manera que esta modificación se transmita a la descendencia, o bien transfiriendo genes a un animal de la misma especie o de una especie diferente.

En la actualidad los animales transgénicos se aplican con fines diversos:

Para ayudar a los investigadores a identificar, aislar y caracterizar los genes, y así entender cómo funcionan.
Como modelos de enfermedades que afectan al hombre, con el fin de desarrollar nuevas drogas y nuevas estrategias de tratamiento.
Como fuente de tejidos y órganos para transplantes en humanos.
Para mejoramiento del ganado y otros animales de importancia económica.
Para producir leche con mayor valor nutricional o que contenga proteínas de importancia farmacéutica.

“Biofábricas” de moléculas
El concepto "fábrica de moléculas" (en inglés “molecular pharming”) se utiliza para designar el uso de plantas y de animales en la producción de moléculas de interés para diferentes industrias, como la farmacéutica, la alimenticia, la química, etc. Por ejemplo, se pueden modificar genéticamente plantas con el fin de producir la proteína del pegamento de los bivalvos que serviría en ortodoncia, o la proteína mayoritaria de la tela de araña que por su resistencia se podría aplicar en la fabricación de ropa antibalas, o introducir genes cuyos productos puedan ser utilizados para el tratamiento de enfermedades en humanos (por ejemplo, anticuerpos).
Con el advenimiento de las técnicas de ingeniería genética que permitieron obtener animales transgénicos surgió también la posibilidad de utilizar a los animales para la producción de proteínas recombinantes de interés farmacológico. Es decir, producir estas proteínas recombinantes en animales en vez de en biorreactores o fermentadores industriales. La estrategia de utilizar animales de granja (ovejas, vacas, cerdos, cabras, gallinas, conejos, etc.) como fábricas de productos farmacológicos recombinantes se denominó “Granja farmacológica”, un término adaptado del concepto de “Molecular Pharming” (“farm” en inglés significa granja, y a su vez hace alusión a la farmacología). Así, en este caso, el nuevo biorreactor es un animal transgénico.
Los fármacos provenientes de organismos transgénicos se producen hoy en día básicamente en tres sistemas: bacterias (fundamentalmente E. Coli), en levaduras, y en células de mamífero (en placas de laboratorio). Próximamente se supone que estarán en el mercado las proteínas farmacológicas provenientes de plantas transgénicas y de animales transgénicos.

¿Cómo se obtiene un animal transgénico?
Cuando se quiere expresar proteínas farmacológicas para abastecer grandes demandas, se debe pensar en producirlas en grandes cantidades. Pero, a su vez, la producción de estas proteínas dentro del animal no debe interferir con la biología misma del organismo. Por ello se pensó en obtener las nuevas moléculas a partir de la leche de los animales de granja. Las ventajas de esta estrategia consisten en que es un método natural con muy bajo impacto ambiental (no se utilizan plantas industriales para la producción de la proteína), y el costo de producción es relativamente bajo. Además, la leche es un fluido corporal renovable secretado por los mamíferos en cantidades sustanciales, que permite una purificación relativamente simple de la proteína de interés.
Se puede dividir el trabajo de obtención de un animal transgénico en tres partes:
a) Construcción del transgén, que incluye el gen de interés.
b) Transgénesis o transferencia del gen a las células de mamíferos.
c) Detección de la proteína recombinante.
Una vez producido un animal transgénico, se lo puede clonar para obtener una descendencia importante genéticamente idéntica que, por lo tanto, producirá también la nueva molécula de interés.
a) Construcción del transgén
Dado que el objetivo es que la proteína recombinante se produzca en la glándula mamaria para que sea secretada en la leche, sin interferir con el crecimiento y metabolismo del animal, es fundamental armar la construcción genética utilizando un elemento (promotor) que permita la expresión del gen únicamente en la glándula mamaria. Para ello se utiliza el promotor del gen de la caseína del mismo animal, que es la proteína mayoritaria de la leche y que se expresa sólo en glándula mamaria para ser secretada a la leche.

b) Transgénesis del animal
Existen varias técnicas para transferir genes a células de mamíferos con el objetivo de que dicha secuencia se integre al genoma. Una de ellas es la microinyección del ADN de interés directamente en un óvulo fecundado, como muestra la siguiente imagen:

Para la microinyección se utiliza una micro-jeringa que se carga con el ADN que se quiere inyectar, una micropipeta para sostener al óvulo fecundado y se realiza la inyección bajo un microscopio.Microfotografías obtenidas por el Centro de Recursos para la Investigación (RRC) de la Universidad de Illinois

Los cigotos así obtenidos son luego implantados en el útero de una madre adoptiva, o receptora, que ha sido preparada hormonalmente para poder llevar adelante la gestación.
Otra técnica que se encuentra en desarrollo para ser aplicada a animales de granja, consiste en transferir el gen de interés a las células de un embrión de mamífero que proliferan in vitro y conservan su capacidad de poder diferenciarse a otros tipos celulares. Cuando el embrión sigue su desarrollo en el útero de una madre receptora, se forma un animal con células transgénicas.

c) Detección de la proteína
Una vez nacidos los animales hay que determinar que sean transgénicos, es decir, que contengan al menos una copia del transgén y que lo expresen, es decir, que produzcan la proteína. Si la proteína de interés farmacológico se produce en la leche del animal, sólo cuando el animal comienza a producir leche se puede detectar la proteína. En ese caso, la proteína se purifica y se obtiene el producto farmacológico deseado.

Clonación de animales

Cuando se quieren tener muchos animales transgénicos idénticos que produzcan la misma proteína recombinante de interés, se recurre a la clonación. Esta técnica permite obtener individuos genéticamente idénticos al animal deseado. El siguiente esquema representa una forma de realizar la técnica de clonación, denominada de transferencia nuclear:

Se toma el núcleo de alguna célula del cuerpo del animal que se quiere clonar (animal A). Ese núcleo tiene toda la información genética que determina las características de ese individuo. Este núcleo se introduce en un óvulo de otro individuo al que previamente se le quitó el núcleo (animal B). De esta forma, se obtiene una célula que se asemeja a un cigoto. Este cigoto realiza in vitro las primeras divisiones mitóticas hasta convertirse en embrión de unas pocas células y entonces es implantado en el útero de una madre adoptiva (animal C). A partir de ese cigoto se desarrolla un individuo exactamente igual a aquel individuo que donó su material genético. En total son necesarios 3 animales: el que se quiere clonar que aporta el núcleo, una hembra que aporta óvulos y otra adoptiva que llevará a cabo la preñez.
Existe otra técnica de clonación, denominada “clonación por fusión nuclear” que es similar a la anterior pero en lugar de tomar el núcleo de la célula, se fusiona una célula completa del animal que se quiere clonar (animal A) con un óvulo de otro animal (B) al que se le ha extraído el núcleo. Esa fusión genera un óvulo con toda la carga cromosómica completa, es decir, un cigoto, el cual se desarrollará en embrión in vitro y luego será implantado en una madre adoptiva (animal C).

Algunos animales de granja transgénicos
La primera oveja transgénica fue Tracy y vivió entre 1991 y 1998. Tracy producía
a1-antitripsina en la leche, un medicamento para tratar la fibrosis quística, una enfermedad que afecta los pulmones. Posteriormente, se conoció a Dolly, que aunque fue más famosa y “mediática”, no era transgénica sino clonada.
Animales transgénicos y clonados, industria argentina.
La primera vaca transgénica argentina se llama Pampa Mansa, y fue producida en 2002. Pampa Mansa, transgénica y clonada, produce la hormona de crecimiento humano para tratar casos de enanismo, y comenzó a dar leche con buenos niveles de hormona de crecimiento en octubre de 2003. Los pasos para la obtención de Pampa Mansa se muestran en el siguiente esquema:

La técnica empleada consiste en la fusión de un óvulo de vaca no fecundado al que se le quitó el núcleo, con una célula de una vaca que fue previamente transformada mediante la introducción del gen humano que codifica para la hormona de crecimiento humana. La célula que contiene el transgén en este caso fue un fibroblasto (un tipo de célula que forma parte del tejido conectivo). Como resultado de la fusión se origina un cigoto transgénico, que se desarrolla en embrión y se implanta dentro de una vaca madre “portadora”, hasta su nacimiento.

Posteriormente, en febrero de 2004 se obtuvo la segunda generación de animales transgénicos, Pampa Mansa II y III, clones obtenidos a partir de Pampa Mansa. La técnica empleada se muestra en la infografía siguiente extraída del Diario Clarín del 7 de febrero de 2004.

Un óvulo no fecundado de la vaca Aberdeen Angus, al que se le quitó el núcleo, se fusionó con un fibroblasto de Pampa Mansa, que ya tiene en su material genético el gen que expresa la hormona de crecimiento humana. El embrión obtenido se desarrolló dentro de otra vaca, de la que nacieron Pampa Mansa II y III que son clones de Pampa Mansa.

Cuaderno 05

2008-02-09T00:14:00.000-02:00

Este cuaderno aporta una introducción a los conceptos básicos de ingeniería genética que se amplían y complejizan en cuadernos siguientes.
Uno de los aspectos básicos que se puede trabajar a partir de este cuaderno es la existencia de biodiversidad y las posibilidades que ofrece la biotecnología de transferir caracteres de un organismo a otro que no los posee, y las ventajas que esto representa. A su vez esto se relaciona con el concepto de código genético universal que posibilita que un gen de un organismo se pueda expresar en otro organismo de una especie diferente.

¿Qué es la Ingeniería Genética?

De los genes a la ingeniería genética

Cuando los científicos comprendieron la estructura de los genes y cómo la información que portaban se traducía en funciones o características, comenzaron a buscar la forma de aislarlos, analizarlos, modificarlos y hasta de transferirlos de un organismo a otro para conferirle una nueva característica.
Justamente, de eso se trata la ingeniería genética, que se podría definir como un conjunto de metodologías que permite transferir genes de un organismo a otro y expresarlos (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen.
El ADN que combina fragmentos de organismos diferentes se denomina ADN recombinante. En consecuencia, las técnicas que emplea la ingeniería genética se denominan técnicas de ADN recombinante. Así, es posible no sólo obtener proteínas recombinantes de interés sino también mejorar cultivos y animales.
Los organismos que reciben un gen que les aporta una nueva característica se denominan organismos genéticamente modificados (OGM) o transgénicos. A su vez, la ingeniería genética es lo que caracteriza a la biotecnología moderna que implementa estas técnicas en la producción de bienes y servicios útiles para el ser humano, el ambiente y la industria.

Etapas para la obtención de un organismo transgénico
Técnicas de Ingeniería Genética o del ADN Recombinante
La obtención de un organismo transgénico mediante técnicas de ingeniería genética implica la participación de un organismo que dona el gen de interés y un organismo receptor del gen que expresará la nueva característica deseada. Por ejemplo, para el caso particular de la producción de una variedad de maíz que resista el ataque de insectos, el organismo dador es la bacteria del suelo denominada Bacillus thuringiensis (Bt) de la cual se extrae el gen que determina la síntesis de la proteína insecticida, y el organismo receptor del gen es la planta de maíz. Las etapas y técnicas involucradas en este proceso serían:

1. Corroborar que existe un gen que codifica para la característica de interés. Cuando se encuentra una característica en un organismo que resulta interesante para transferir a otro organismo debe verificarse que es producto de un gen. Se identifica el gen de interés por medio de cruzamientos a partir de una característica que se expresa, y se verifican las proporciones mendelianas. Si la característica se atribuye a una proteína, que es producto directo de un gen, será más sencillo transferir esa característica a un organismo que no la tiene.

2. Clonar el gen de interés. Clonar un gen significa tenerlo puro en el tubo de ensayos, o mejor aún, dentro de un vector (una molécula mayor de ADN que permite guardar fragmentos de ADN en forma estable y práctica por más tiempo). La tarea de clonar un gen involucra varias técnicas: i) Extracción de ADN; ii) Búsqueda de un gen entre la mezcla de genes del ADN; iii) Secuenciación; iv) Construcción del vector recombinante.
El ADN de interés se inserta en plásmidos-vectores que son moléculas de ADN lineales o circulares en las cuales se puede “guardar” (clonar) un fragmento de ADN. Los más usados son los plásmidos de origen bacteriano.

Los plásmidos pueden extraerse de las bacterias e incorporarse a otras, a través del proceso de transformación. Los plásmidos fueron modificados por los investigadores para ser empleados como vectores (vehículos). Así, el gen de interés puede insertarse en el plásmido-vector e incorporarse a una nueva célula.

El desarrollo de estas técnicas fue posible en gran medida por el descubrimiento de las enzimas de restricción. Las enzimas de restricción reconocen secuencias determinadas en el ADN. De esta manera, conociendo la secuencia de un fragmento de ADN, es posible aislarlo del genoma original para insertarlo en otra molécula de ADN. Hay muchas enzimas de restricción obtenidas a partir de bacterias y que sirven como herramientas para la ingeniería genética.

Las enzimas de restricción reconocen secuencias de 4, 6 o más bases y cortan generando extremos romos o extremos cohesivos. Estos extremos, generados en diferentes moléculas de ADN, pueden sellarse con la enzima ADN ligasa y generar así una molécula de ADN nueva, denominada recombinante.

Para tener gran cantidad y fácil disponibilidad del ADN de interés, el vector se inserta dentro de bacterias (E. coli), las cuales crecen fácil y rápidamente. O sea, la bacteria se utiliza como “multiplicadora” del vector, y por ende del inserto de interés. Esta es una etapa de “amplificación” del ADN para poder tener gran cantidad para secuenciarlo, caracterizarlo, y luego poder hacer con él ADN recombinante.

En placas de Petri se cultivan las bacterias. Se originan colonias de bacterias iguales (clones). Las bacterias transformadas, que incorporaron el plásmido y el gen de interés, se seleccionan por medio de antibióticos y por reacciones con indicadores de color.

3. Caracterizar el gen de interés. A partir de conocer la secuencia del gen se puede, mediante bioinformática, comparar esta secuencia con las de genes ya conocidos para determinar a qué gen se parece, y se le asigna una posible función. Una vez predicha la función del gen clonado por medio de análisis informático, se debe proceder a confirmar la función real in vivo, o sea corroborar que en un sistema biológico funciona acorde a lo que se prevé. Para ello se suele transferir el gen a un organismo modelo, en el cual se pueda expresar el gen y medir su función. En el ejemplo del maíz, el gen Bt se puede transferir primero a las especies modelo Arabidopsis thaliana y Nicotiana tabacum (ver cuaderno 07).

4. Modificar el gen de interés. Si así se desea se puede agregar, deletar o mutar secuencias dentro de la región codificante, y agregar secuencias (promotor, terminador, intrones) para que se pueda expresar en el sistema de interés. Por ejemplo: si se clona un gen Bt de una bacteria para luego ponerlo en maíz, se debe agregar un promotor que funcione bien en plantas, es decir, que permita que las células vegetales expresen la proteína Bt. El promotor es una región fundamental del gen ya que determina cuándo y dónde se expresará el gen.

Fuente: http://www.agronort.com/informacion/abcbiotec/abcbio6.html

5. Transformación de un organismo con el gen de interés. Una vez hecha la construcción genética con el gen y promotor deseado, se elige el método de transformación más indicado para el organismo que se desea hacer transgénico ( para animales ver Cuaderno N°8).

6. Caracterización del OGM. Una vez obtenido el OGM, se lo analiza desde el punto de vista molecular y biológico. Para el análisis molecular se debe demostrar, entre otras cosas, si tiene una (o más) copias del transgén, y cómo y en qué tejidos se expresa el gen. Para analizar en qué tejido, momento y cantidad se expresa el gen se analiza la presencia del ARN mensajero y de la proteína recombinante codificados por el transgén (ver Cuaderno Nº 49 y Nº67). Para la caracterización biológica, el OGM se analiza desde el punto de vista del objetivo (en este ejemplo, si el maíz resulta efectivamente resistente a los insectos) y desde el punto de vista que sea necesario acorde al OGM en cuestión. Si será utilizado como alimento y se lo cultivará a campo, entonces se deberá hacer el análisis de riesgo alimentario y ambiental.

Hasta el momento se ha utilizado la ingeniería genética para producir, entre otras aplicaciones:
Vacunas, por ejemplo contra la hepatitis B
Fármacos, como la insulina y la hormona del crecimiento humano, tanto en células transformadas y crecidas in vitro como en bacterias recombinantes y animales transgénicos
Enzimas para disolver manchas, como las que se usan en los detergentes en polvo, mayormente por medio de microorganismos recombinantes (transgénicos) que crecen en biorreactores.
Enzimas para la industria alimenticia, como las empleadas en la elaboración del queso y en la obtención de jugos de fruta, entre otras.

Plantas resistentes a enfermedades, entre otras características.

Cuaderno 04

2008-02-08T23:48:00.000-02:00

El objetivo de este Cuaderno es sentar las bases que permitan luego comprender aspectos más avanzados o complejos de la biotecnología moderna y las técnicas de ingeniería genética que se tratan en los siguientes Cuadernos.
Se propone profundizar y trabajar los aspectos vinculados con la estructura química de la molécula de ADN, así como de las otras biomoléculas, y relacionarlas con su función.

ADN, genes y código genético

Del ADN a la biotecnología moderna
El conocimiento del ADN (ácido desoxirribonucleico), su estructura y función, fue determinante para el desarrollo de la biotecnología moderna.
La estructura de doble hélice del ADN, que los investigadores James Watson y Francis Crick propusieran en 1953 proporcionó respuestas a muchas preguntas que se tenían sobre la herencia. Predijo la autorreplicación del material genético y la idea de que la información genética estaba contenida en la secuencia de las bases que conforman el ADN. Más aún, con el correr de los años y de las investigaciones, se pudo determinar que todos los seres vivos contienen un ADN similar, formado a partir de las mismas unidades: los nucleótidos. Este código genético mediante el cual se “escriben” las instrucciones celulares es común a todos los organismos. Es decir que el ADN de un ser humano puede ser “leído” dentro de una bacteria, y una planta puede interpretar la información genética de otra planta diferente. A esta propiedad de la información genética se la conoce como “universalidad del código genético”.
El código genético universal es uno de los conceptos básicos para comprender los procesos de la biotecnología moderna. Por ejemplo, la posibilidad de generar organismos transgénicos, y que las instrucciones del ADN de un organismo puedan determinar nuevas características en organismos totalmente diferentes.

La función del ADN
El ADN tiene la función de “guardar información”. Es decir, contiene las instrucciones que determinan la forma y características de un organismo y sus funciones. Además, a través del ADN se transmiten esas características a los descendientes durante la reproducción, tanto sexual como asexual. Todas las células, procariotas y eucariotas, contienen ADN en sus células. En las células eucariotas el ADN está contenido dentro del núcleo celular, mientras que en las células procariotas, que no tienen un núcleo definido, el material genético está disperso en el citoplasma celular.

La estructura del ADN
El ADN está organizado en cromosomas. En las células eucariotas los cromosomas son lineales, mientras que los organismos procariotas, como las bacterias, presentan cromosomas circulares. Para cada especie, el número de cromosomas es fijo. Por ejemplo, los seres humanos tienen 46 cromosomas en cada célula somática (no sexual), agrupados en 23 pares, de los cuales 22 son autosomas y un par es sexual. Una mujer tendrá un par de cromosomas sexuales XX y un varón tendrá un par XY.
Cada cromosoma tiene dos brazos, ubicados por arriba y por debajo del centrómero. Cuando los cromosomas se duplican, previo a la división celular, cada cromosoma está formado por dos moléculas de ADN unidas por el centrómero, conocidas como cromátidas hermanas.

Esquema de un cromosoma duplicado

El ADN se compone de dos cadenas, cada una formada por nucleótidos. Cada nucleótido, a su vez, está compuesto por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada. Las bases nitrogenadas son cuatro: adenina (A), timina (T), citosina (C), y guanina (G), y siempre una A se enfrenta a una T y una C se enfrenta a una G en la doble cadena. Las bases enfrentadas se dice que son complementarias. El ADN adopta una forma de doble hélice, como una escalera caracol donde los lados son cadenas de azúcares y fosfatos conectadas por “escalones”, que son las bases nitrogenadas. La molécula de ADN se asocia a proteínas, llamadas histonas, y se encuentra muy enrollada y compactada para formar el cromosoma. Esta asociación de ADN y proteínas se conoce como cromatina. La cromatina puede estar enrollada en mayor o menor grado, dependiendo de la etapa en que se encuentra la célula; por ejemplo, cuando el ADN se ha duplicado antes de que la célula se divida, la cromatina se compacta en su mayor grado, y como resultado se pueden visualizar los cromosomas duplicados al microscopio como corpúsculos con forma de X.

http://images.clinicaltools.com/images/gene/dnabasepairs.jpg

La doble hélice de ADN con las bases nitrogenadas complementarias que se ubican hacia dentro y establecen uniones no covalentes (o fuerzas de atracción) entre sí que mantienen la estructura de la molécula. Las desoxirribosas (azúcares) y los grupos fosfato constituyen las columnas de la molécula.

FUENTE: http://www1.geneticsolutions.com/PageReq?id=1530:1873#Molecular%20Genetics
La imagen representa una célula eucariota en la cual se amplía un cromosoma, y se muestra la estructura del ADN que lo constituye. Un fragmento particular del ADN forma un gen que determina una característica particular. El ADN se forma a partir de la unión de nucleótidos, que pueden tener cuatro bases nitrogenadas diferentes: A, T, C, G.

Cuando la célula se divide, cada nueva célula que se forma debe portar toda la información genética, que determine sus características y funciones. Para eso, antes de dividirse, el ADN debe replicarse, es decir generar una copia de sí mismo. Durante la replicación, la molécula de ADN se desenrolla, separando sus cadenas. Cada una de éstas servirá como molde para la síntesis de nuevas hebras de ADN. Para eso, la enzima ADN-polimerasa coloca nucleótidos siguiendo la regla de apareamiento A-T y C-G. El proceso de replicación del ADN es semiconservativo, ya que al finalizar la duplicación, cada nueva molécula de ADN estará conformada por una hebra “vieja” (original) y una nueva.

http://images.clinicaltools.com/images/gene/dnareplication.jpg
Replicación semiconservativa del ADN de una célula eucariota.

¿Cómo se interpretan las instrucciones escritas en el ADN?
La información está guardada en el ADN en el código de secuencia de bases A, T, C y G que se combinan para originar “palabras” denominadas genes. Los genes son fragmentos de ADN cuya secuencia nucleotídica codifica para una proteína. Es decir que a partir de la información “escrita” en ese fragmento de ADN se fabrica (sintetiza) un tipo particular de proteína. Aunque, en realidad, los genes también llevan la información necesaria para fabricar moléculas de ARN (ribosomal y de transferencia) que intervienen en el proceso de síntesis de proteínas. El ARN (ácido ribonucleico) es una molécula con una estructura similar al ADN.
Un gen no es una estructura que se vea sino que se define a nivel funcional. Es una secuencia que va a empezar en algún lugar del ADN y va a terminar en otro. Para conocer un gen se secuencia, se determina la cantidad de los nucleótidos que lo forman y el orden en que se ubican.
Todas las células de un organismo tienen el mismo genoma, o conjunto de genes. Pero, en cada célula se expresan los genes que se usan. Por ejemplo, aunque una célula de la piel tiene toda la
información genética al igual que la célula del hígado, en la piel solo se expresarán aquellos genes que den características de piel, mientras que los genes que dan características de hígado, estarán allí “apagados”. Por el contrario, los genes que dan rasgos de “hígado” estarán activos en el hígado e inactivos en la piel. Lo que no se usa se encuentra mayormente compactado. Este empaquetamiento puede ser temporal o definitivo.

La síntesis de proteínas
Las proteínas son macromoléculas que cumplen funciones variadas. Hay proteínas estructurales, otras son enzimas, otras transportan oxígeno como la hemoglobina, hay proteínas involucradas en la defensa inmunitaria, como los anticuerpos, otras cumplen funciones de hormonas como la insulina, etc.
Así como el ADN está compuesto a partir de nucleótidos, las proteínas están compuestas a partir de aminoácidos. Hay 20 aminoácidos diferentes, y cada proteína tiene una secuencia de aminoácidos particular.
El proceso de síntesis de proteínas consta básicamente de dos etapas: la transcripción y la traducción. En la primera etapa, las “palabras” (genes) escritas en el ADN en el lenguaje de los nucleótidos se copian o transcriben a otra molécula, el ARN mensajero (ARNm). Luego, en la etapa siguiente, el ARNm se traduce al idioma de las proteínas, el de los aminoácidos. Este flujo de información se conoce como el “dogma central de la biología”.

http://images.clinicaltools.com/images/gene/mrnahighlight3.jpg
Proceso de síntesis de proteínas en una célula eucariota. La transcripción ocurre dentro del núcleo y la traducción en los ribosomas en el citoplasma.

La transcripción
Durante la transcripción la enzima ARN polimerasa, copia la secuencia de una hebra del ADN y fabrica una molécula de ARN complementaria al fragmento de ADN transcripto. El proceso es similar a la replicación del ADN, pero la molécula nueva que se forma es de cadena simple y se denomina ARN. Se denomina ARN mensajero porque va a llevar la información del ADN hacia los ribosomas, las organelas encargadas de fabricar las proteínas. El ARN, o ácido ribonucleico, es similar al ADN aunque no igual.

http://www.answers.com/main/content/wp/en/thumb/e/eb/300px-RNA-comparedto-DNA.png
Como muestra la imagen, el ARN se diferencia del ADN en que es de cadena simple, en lugar del azúcar desoxirribosa tiene ribosa, y en lugar de la base nitrogenada timina, (T), tiene uracilo (U).

La traducción y el código genético
La molécula del ARN mensajero se traslada a los ribosomas donde ocurre la etapa de traducción. Durante esta etapa el ribosoma lee la secuencia de nucleótidos del ARN mensajero por tripletes o tríos de nucleótidos, denominados codones. A medida que el ribosoma lee la secuencia de codones va formando una proteína, a partir de la unión de aminoácidos. Según cuál es el codón que el ribosoma “lee” va colocando el aminoácido que corresponde. Si se considera la combinación de cuatro bases tomadas de a tres, existe un total de 64 codones posibles. Cada codón determina qué aminoácido se colocará en la proteína que se está fabricando. De los 64 codones, 61 corresponden a aminoácidos y 3 son codones de terminación (stop), responsables de la finalización de la síntesis proteica.
La siguiente tabla es el código genético o “diccionario” que permite traducir la información escrita en el lenguaje de los ácidos nucleicos (nucleótidos) al lenguaje de las proteínas (aminoácidos), y es universal, o sea, es válido para todos los seres vivos.
http://images.clinicaltools.com/images/gene/codontable.jpg
La tabla del código genético es universal y permite conocer a partir de la secuencia del ARN mensajero cómo será la secuencia de la proteína para la cual el gen correspondiente codifica.

Así, la secuencia ATG (AUG en el ARNm) codifica para el aminoácido metionina, y el codón TTT (UUU en el ARNm) codifica para el aminoácido fenilalanina en todos los organismos vivos. Como sólo existen 20 aminoácidos en la naturaleza, varios codones pueden codificar para el mismo aminoácido (por ejemplo, al aminoácido glicina le corresponden los codones GGU, GGC, GGA y GGG).
Cada codón del ARNm es leído por otro ARN, llamado ARN de transferencia (ARNt), que actúa como un “adaptador” entre la información que lleva el ARNm y los aminoácidos que deben ir colocándose para formar la proteína correspondiente. El ARNt es muy pequeño comparado con los ARNm y tiene una secuencia, denominada anticodón que aparea (es decir, es complementaria) con el codón. Cada ARN de transferencia tiene un anticodón y “carga” un aminoácido en particular. Por ejemplo, el ARNt que tiene el anticodón UCA, se aparea al codón AGU, y carga el aminoácido serina (Ser). De la misma manera, el ARNt que carga tirosina (Tyr) se aparea, a través de su anticodón, con el codón UAC. Así se va formando una cadena polipeptídica (proteína) a medida que los anticodones de los ARNt reconocen sus respectivos codones en el ARNm. Este proceso de síntesis proteica ocurre en los ribosomas.

¿Qué son las mutaciones?
A veces, y este es un fenómeno relativamente frecuente, la enzima que se encarga de la replicación del ADN (ADN polimerasa) se equivoca, es decir, coloca un nucleótido en lugar de otro. Si, por ejemplo, la enzima ADN polimerasa coloca una T en lugar de una A podría ocurrir que al traducirse, se coloque en la proteína un aminoácido diferente del que correspondería. Por lo tanto, la proteína generada sería diferente en un aminoácido a la original. Este cambio en el ADN, llamado mutación, podría alterar o anular la función de la proteína.
Este ejemplo ilustra el efecto de los cambios o mutaciones puntuales (debidos a un único cambio en la secuencia) en la proteína final. En algunos casos las mutaciones pasan inadvertidas, pero también pueden provocar la falta de actividad de una proteína esencial y causar una enfermedad. De todas formas, la mayoría de las mutaciones no se manifiestan, o porque están en regiones del ADN donde no hay genes, o porque no cambian el aminoácido, o porque ese cambio no altera la función de la proteína. O bien podría alterarse la función y esto no resultar perjudicial. Tal es el caso del carácter color de ojos, donde el color claro se produce por falta de ciertas enzimas que fabrican los pigmentos del iris.
En realidad, las mutaciones son la base de la biodiversidad. Es decir que las pequeñas diferencias en el ADN es lo que determina que los seres vivos sean diferentes entre sí. Esta diversidad en las características sumada a la existencia de un código genético común entre los seres vivos, son dos hechos determinantes en el desarrollo de la biotecnología moderna.

El ADN y la biotecnología moderna
Cuando los científicos comprendieron la estructura de los genes y cómo la información que portaban se traducía en funciones o características, comenzaron a buscar la forma de aislarlos, analizarlos, modificarlos y hasta de transferirlos de un organismo a otro para conferirle una nueva característica. Justamente, de eso se trata la ingeniería genética, a la que podríamos definir como un conjunto de metodologías que nos permite transferir genes de un organismo a otro, y que dio impulso a la biotecnología moderna. La ingeniería genética permite clonar (multiplicar) fragmentos de ADN y expresar genes (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen. Así, es posible obtener proteínas de interés en organismos diferentes del original del cual se extrajo el gen, mejorar cultivos y animales, producir fármacos, y obtener proteínas que utilizan diferentes industrias en sus procesos de elaboración.

Cuaderno 03

2008-02-08T21:09:00.001-02:00

El objetivo de este Cuaderno es aportar al conocimiento de un concepto fundamental como es el ADN, su estructura y función. Esto permite comprender no sólo aspectos más avanzados o complejos de la biotecnología moderna y las técnicas de ingeniería genética, sino asociarlo con noticias que se difunden actualmente en los medios de comunicación referidas al análisis de ADN y a su aplicación para la resolución de crímenes, para definir relaciones de parentesco y también para el estudio de temas como la evolución.

Los ácidos nucleicos, estructura y función

Algo de historia ...
“Hemos encontrado el secreto de la vida”, se escuchó un 28 de Febrero de 1953 en el bar The Eagles, en Inglaterra. Esta frase fue la conclusión de un largo trabajo de un equipo de científicos en Cambridge que estaba dedicado a averiguar la estructura de la molécula de ADN. El biólogo estadounidense James Watson y el físico inglés Francis Crick, que trabajaban en el Laboratorio Cavendish de Cambridge, se habían especializado en el empleo de los rayos X para deducir la estructura de las moléculas biológicas. Sin embargo, hasta ese momento los resultados que se obtenían eran muy imprecisos. Los científicos suponían que la molécula de ADN era helicoidal, incluso habían demostrado matemáticamente que, si realmente tenía esa forma, en las fotografías de la difracción de los rayos X aparecería reflejada como una cruz. Esta premisa fue confirmada al observar la fotografía obtenida por la científica británica Rosalind Franklin (ver Cuaderno 02).
Paralelamente, el químico de Cambridge Alexander Tood, había completado el análisis del ADN, que demostraba que la estructura estaba formada por unas largas cadenas de azúcar y fósforo unidas por unas moléculas planas o bases que contenían carbono y nitrógeno (bases nitrogenadas: adenina, guanina, timina y citosina).
Además, contaron con la información del descubrimiento del bioquímico americano Erwin Chargaff que había demostrado que, en cada muestra de ADN la cantidad de la base adenina era la misma que la de timina, mientras que la de guanina se correspondía con la de citosina. Con todos estos datos, Watson y Crick comenzaron a construir modelos, hasta que finalmente encontraron el que se correspondía con las investigaciones previas: el modelo de doble hélice del ADN. Dos meses más tarde, el descubrimiento fue publicado en la prestigiosa revista científica Nature.
El conocimiento de la estructura del ADN abrió el camino a nuevas áreas de investigación dentro de la biología. Aparte de sus innumerables repercusiones en bacteriología y en virología (permitió establecer cómo los virus infectan las células), hay que resaltar su contribución a la ingeniería genética.

¿Qué son los Ácidos nucleicos?
Tanto el ADN como el ARN pertenecen a un tipo de moléculas llamadas “ácidos nucleicos”. El descubrimiento de estos ácidos se debe al investigador Friedrich Meischer (1869), el cual investigaba los leucocitos y espermatozoides de salmón, de los cuales obtuvo una sustancia rica en carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y un porcentaje elevado de fósforo. Por encontrarse dentro del núcleo, llamó a esta sustancia nucleina.
Años más tarde, se encontró que tenía un componente proteico y un grupo prostético (no proteico). Debido a que este último es de carácter ácido, a la nucleína se la pasó a llamar ácido nucleico.

La estructura de los ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos son biopolímeros formados a partir de unidades llamadas monómeros, que son los nucleótidos. Durante los años 20, el bioquímico P.A. Levene analizó los componentes del ADN.

Encontró que los nucleótidos se forman a partir de la unión de:
a) Un azúcar de tipo pentosa (cinco átomos de carbono). Puede ser D-ribosa en el ARN, o D-2- desoxirribosa, en el ADN.

Adaptado de http://www.arrakis.es/~lluengo/biologia.html

En este esquema se muestra la estructura química de los dos tipos de azúcares que forman el ADN y ARN. La diferencia entre ambas, radica en la presencia de un grupo hidroxilo o alcohol (-OH) en la ribosa o un hidrógeno (-H) en la desoxirribosa, unidos al Carbono 2. Los números indican la posición de cada uno de los cinco carbonos de la molécula de azúcar.

b) Una base nitrogenada. Son compuestos orgánicos cíclicos, que incluyen dos o más átomos de nitrógeno y son la parte fundamental de los ácidos nucleicos. Biológicamente existen cinco bases nitrogenadas principales, que se clasifican en dos grupos:
- Las Bases Purínicas, derivadas de la estructura de las Purinas (con dos anillos): la Guanina (G) y la Adenina (A). Ambas bases se encuentran tanto en el ADN como el ARN.
- Las Bases Pirimidínicas, derivadas de la estructura de las Pirimidinas (con un anillo): la Timina (T), Citosina (C) y Uracilo (U). La timina sólo se encuentra en la molécula de ADN, el uracilo sólo en la de ARN y la citosina, en ambos tipos de macromoléculas.

Adaptado de: http://www.arrakis.es/~lluengo/biologia.html
Esquema de los cinco tipos de bases nitrogenadas presentes en los ácidos nucleicos. Las mismas se encuentran divididas en dos grupos según su estructura química: las purinas y las pirimidinas.

c) Ácido fosfórico, que en la cadena de ácido nucleico une dos pentosas a través de una unión fosfodiester.

El ácido fosfórico une dos moléculas de azúcar. Esta unión se hace entre el C-3 de una pentosa, con el C-5 de la siguiente.
Entonces, cada nucleótido del ADN tiene la siguiente estructura:

Los nucleótidos monofosfatados están formados por tres componentes: un grupo fosfato unido al azúcar pentosa, mediante una unión de tipo éster (un átomo de O se une a otros dos) en la posición del Carbono 5 del azúcar. A su vez, el azúcar se une a una base nitrogenada en la posición de su Carbono 1. En los ribonucleótidos (del ARN) la pentosa es la D-ribosa, en los desoxirribonucleótidos (del ADN), el azúcar es 2´-desoxi-D-ribosa.

Los nucleótidos se enlazan para formar polímeros: los ácidos nucleicos o polinucleótidos.
En la estructura de los ácidos nucleicos, las bases nitrogenadas son complementarias entre sí. La adenina y la timina son complementarias (A-T), al igual que la guanina y la citosina (G-C). Dado que en el ARN no existe timina, la complementariedad se establece entre adenina y uracilo (A-U). La complementariedad de las bases es la clave de la estructura del ADN y tiene importantes implicaciones, pues permite procesos como la replicación del ADN y la traducción del ARN en proteínas.
En las hebras enfrentadas A se une con T mediante dos puentes hidrógeno, mientras que G se une con C mediante tres. Entonces, la adhesión de las dos hebras de ácido nucleico se debe a este tipo especial de unión química conocido como puente de hidrogeno.

Las uniones puentes de hidrógeno son más débiles que otros enlaces químicos, como interacciones hidrófobas y enlaces de Van der Waals. Esto significa que las dos hebras de la hélice pueden separarse con relativa facilidad, quedando intactas.

Las largas cadenas de nucleótidos se forman por la unión del C5' de la pentosa con el grupo fosfato formando un nucleótido monosfato.

La cadena se va formando al enlazar los fosfatos al C3' de otro nucleótido. Así la cadena tiene un extremo 5´y un extremo 3´.

Las distintas estructuras del ADN

Se pueden definir distintas estructuras que adopta el ADN: primaria, secundaria y terciaria, haciendo una analogía con las estructuras de las proteínas.

Estructura primaria: La estructura primaria del ADN está determinada por la secuencia en que se encuentran ordenadas las cuatro bases sobre la "columna" formada por los nucleósidos: azúcar + fosfato. Este orden es lo que se transmite de generación en generación (herencia).

Estructura secundaria: corresponde al modelo postulado por Watson y Crick: la doble hélice. Las dos hebras de ADN se mantienen unidas por los puentes hidrógenos entre las bases. Los pares de bases están formados siempre por una purina y una pirimidina, que adoptan una disposición helicoidal en el núcleo central de la molécula. En cada extremo de una doble hélice lineal de ADN, el extremo 3'-OH de una de las hebras es adyacente al extremo 5'-P (fosfato) de la otra. En otras palabras, las dos hebras son antiparalelas es decir, tienen una orientación diferente.

http://www.um.es/molecula/anucl02.htm
Ambas cadenas están siempre equidistantes, a unos 11 Å una de la otra. Las bases se encuentran a 3,4 Amstrongs unas de otras y con una rotación de 36º, de forma que hay 10 pares de bases por cada vuelta de la hélice (sumando 360º).

Esta estructura secundaria, puede desarmarse por un proceso llamado desnaturalización del ADN. Cuando la temperatura alcanza el punto de fusión del ADN, se separan las dos hebras y se produce su desnaturalización. En este proceso se rompen los puentes de hidrógeno que unen las cadenas y se produce la separación de las mismas, pero no se rompen los enlaces fosfodiester covalentes que forman la secuencia de la cadena. Este es un proceso reversible, ya que al bajar la temperatura se puede producir una renaturalización. Cuando una molécula de ADN posee un gran contenido de bases nitrogenadas de tipo C y G (las cuales están unidas por tres puentes de Hidrógeno), las condiciones para la desnaturalización de esa molécula deberán ser más enérgicas, por lo tanto tendrán un punto de fusión mayor.

Estructura terciaria: es la forma en que se organiza la doble hélice. En Procariotas, así como en las mitocondrias y cloroplastos eucariotas el ADN se presenta como una doble cadena (de cerca de 1 mm de longitud), circular y cerrada, que toma el nombre de cromosoma bacteriano. El cromosoma bacteriano se encuentra altamente condensado y ordenado (superenrollado). En los virus, el ADN puede presentarse como una doble hélice cerrada, como una doble hélice abierta o simplemente como una única hebra lineal.
En los Eucariotas el ADN se encuentra localizado en el núcleo, apareciendo superenrollado y asociado con proteínas llamadas histonas. Durante la mitosis, en las células eucariotas la cromatina se enrolla formando cromosomas, que son complejas asociaciones de ADN y proteínas.

Los distintos tipos de ARN
El ARN se encuentra, en una célula típica, en una cantidad 10 veces mayor que el ADN. El azúcar presente en el ARN es la ribosa. Esto indica que en la posición 2' del anillo del azúcar hay un grupo hidroxilo (OH) libre. Por este motivo, el ARN es químicamente inestable, de forma que en una disolución acuosa se hidroliza fácilmente.
En las células, se encuentran varios tipos de ARN, los cuales poseen distinta función y tamaño. Algunos de ellos, son:

ARN mensajero (ARNm): Se sintetiza sobre un molde de ADN por el proceso de transcripción. Este ARN pasa al citoplasma y sirve de pauta para la síntesis de proteínas (traducción).

ARN ribosómico (ARNr): El RNA ribosómico está presente en los ribosomas, orgánulos intracelulares implicados en la síntesis de proteínas. Su función es leer los ARNm y formar la proteína correspondiente.

ARN de transferencia (ARNt): Son cadenas cortas de una estructura básica, que pueden unirse específicamente a determinados aminoácidos.

Estos tres tipos de ARN están implicados en el pasaje de información del lenguaje de los nucleótidos del ADN al de los aminoácidos de las proteínas, en un proceso conocido como “El dogma central de la biología”, que muestra la siguiente figura:

El ADN tiene información para la síntesis de proteínas en el que participa el ARN. Esas proteínas determinan las características de cada organismo y sus funciones.

El ADN como almacén de información
La molécula de ADN es un almacén de información que se trasmite de generación en generación, conteniendo toda la información necesaria para construir y sostener el organismo en el que se encuentra.
Las principales implicadas en este proceso son las proteínas. Estas pueden ser estructurales como las proteínas de los músculos, cartílagos y pelo o bien funcionales como las de la hemoglobina, o la gran cantidad de enzimas del organismo.
La función principal de la herencia es la transmisión del ADN, una especie de receta para la fabricación de proteínas. En ocasiones, la modificación del ADN (mutaciones) provoca un cambio en el funcionamiento de la proteína, que puede resultar beneficioso, perjudicial o intrascendente.
El ADN de un organismo podría clasificarse en dos: el que codifica las proteínas y el que no codifica. En muchas especies de organismos, sólo una pequeña fracción del total de la secuencia del genoma codifica proteínas. Por ejemplo, sólo un 3% del genoma humano consiste en secuencias (conocidas como exones) que codifican proteínas. La función del resto no se conoce con certeza hasta el momento, aunque se sabe que algunas secuencias se unen a ciertas proteínas que tienen un papel importante en el control de los mecanismos de transcripción y replicación. Estas secuencias se llaman frecuentemente reguladoras, y se están desarrollando muchas investigaciones en esta área ya que sólo se ha identificado una pequeña fracción de ellas. La presencia de esa gran cantidad de ADN no codificante en genomas eucarióticos y las diferencias en tamaño de los genomas representan aún una incógnita que hay que resolver.

El ADN y la biotecnología moderna
Cuando los científicos comprendieron la estructura del ADN, de los genes, y cómo la información que portaban se traducía en funciones o características, comenzaron a buscar la forma de aislarlos, analizarlos, modificarlos y hasta de transferirlos de un organismo a otro para conferirle una nueva característica. Justamente, de eso se trata la ingeniería genética, a la que podríamos definir como un conjunto de metodologías que nos permite transferir genes de un organismo a otro, y que dio impulso a la biotecnología moderna. La ingeniería genética permite clonar (multiplicar) fragmentos de ADN y expresar genes (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen. Así, es posible obtener proteínas de interés en organismos diferentes del original del cual se extrajo el gen, mejorar cultivos y animales, producir fármacos, y obtener proteínas que utilizan diferentes industrias en sus procesos de elaboración.

Cuaderno 02

2008-02-08T20:22:00.001-02:00

Uno de los conceptos interesantes que se pueden remarcar a partir de este Cuaderno, es la idea del conocimiento científico como una producción histórica, social y colectiva. A diferencia de la imagen que suele transmitirse del científico encerrado en un laboratorio y aislado del mundo exterior, hoy en día se reconoce que los conocimientos científicos existentes son el resultado de los aportes de muchas generaciones de científicos, y que cada concepto tiene su significado dentro de una teoría que lo incluye. La idea que se propone a partir de este texto no es hacer una historia de la ciencia pero sí contextualizar los contenidos conceptuales en el momento histórico en que fueron producidos, relacionarlos con las concepciones que han precedido al descubrimiento y con las preguntas que han intentado responder.

EL NACIMIENTO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR: EL DESCUBRIMIENTO DE LA ESTRUCTURA DEL ADN

El ADN y la biotecnología

Mucho se habla actualmente del ADN, incluso cada vez más se lo menciona en los medios de comunicación. Estudiar el ADN permite revelar relaciones familiares, resolver hechos delictivos, establecer relaciones evolutivas que datan de millones de años y desarrollar nuevos tratamientos o, posiblemente, la cura para algunos males. El ADN (ácido desoxiribonucleico) se encuentra dentro de cada célula, y contiene la información que determina, en interacción con componentes ambientales, las características que tendrá la célula y el organismo en su totalidad.
Desentrañar la estructura del ADN resultó esencial para comprender procesos celulares, y para desarrollar técnicas de biología molecular y de ingeniería genética, que contribuyeron al avance de la biotecnología moderna. Actualmente, mediante estas técnicas que emplea la biotecnología moderna, es posible transferir ADN de un organismo a otro y conferirle así nuevas características, diseñar nuevos fármacos o mejorar cultivos, entre otras aplicaciones.
Pero la historia del descubrimiento de la estructura y la función del ADN, comenzó hace algunos años atrás.

La historia del ADN
El ADN fue aislado por primera vez por el científico alemán Friedrich Miescher en 1869. Debido a que lo encontró en los núcleos de las células, denominó a este compuesto nucleína. A medida que se fue conociendo la estructura química de esta molécula, se lo llamó ácido nucleico y por último ácido desoxirribonucleico (ADN).
En 1914, el químico alemán Robert Feulgen describió un método para teñir el ADN por medio de un colorante llamado fucsina. Utilizando este método, descubrió que el ADN se encontraba formando parte de los cromosomas.
Seis años más tarde, el bioquímico P.A. Levene , analizó los componentes del ADN. Encontró que contenía cuatro bases nitrogenadas: citosina, timina, adenina y guanina; el azúcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. Por medio de su descubrimiento concluyó que cada unidad básica del ADN, llamada nucleótido, está compuesta de una base nitrogenada unida a un azúcar y ésta unida a su vez a un grupo fosfato.

Figura: Cada nucleótido se forma a partir de la unión de tres subunidades: un grupo fosfato, un azúcar de cinco carbonos y una base nitrogenada, que puede ser adenina, guanina, citosina o timina.
Fuente: http://wwwbioq.unizar.es/EMvirtual/1agua/nucleotido.jpg

El factor de transformación
Ya en esos años, entre los científicos estaban planteadas algunas preguntas: ¿qué sustancia era la encargada de transmitir ciertos caracteres? ¿Cuál era la composición química de los genes?
La respuesta la trajo el estudio de una enfermedad infecciosa mortal: la neumonía. Durante la década de 1920, el médico inglés Frederick Griffith estudió las diferencias entre una cepa de la bacteria Streptococcus peumoniae que producía la enfermedad y otra que no la causaba. La cepa que causaba la enfermedad estaba rodeada de una cápsula de polisacáridos que le daba a las colonias de estas bacterias en las placas de Petri un aspecto liso o suave, por lo cual se las denominó cepa S (smooth, en inglés). La otra cepa no tiene cápsula y no causa neumonía y se la denomina cepa R (rugosa) también por el aspecto de la colonia.
La siguiente ilustración representa la experiencia realizada por Griffith, y los resultados que obtuvo:
Explicación de experiencia. Griffith inyectó las diferentes cepas de la bacteria en ratones. La cepa S mataba a los ratones mientras que la cepa R no lo hacía. Luego comprobó que la cepa S muerta por calentamiento, no causaba neumonía cuando se la inyectaba. Sin embargo cuando inyectaba una combinación de la cepa S muerta con la cepa R viva, los ratones contraían neumonía y morían.
Aún más, en la sangre de estos ratones muertos Griffith encontró neumococos vivos de la cepa S. Es decir que en las bacterias S muertas había “algo” capaz de transformar a las bacterias R, antes inocuas, en patógenas y este cambio era permanente y heredable.

¿Cómo podían las bacterias S muertas transmitirle a las bacterias R vivas la propiedad de enfermar y matar a los ratones?
¿Habría alguna sustancia capaz de pasar de una bacteria a la otra y transmitirle esa nueva propiedad?
¿Qué era el principio transformante?

Luego de los resultados publicados por Griffith, el bacteriólogo canadiense Oswald Avery se propuso descubrir la sustancia que él suponía era el factor responsable del fenómeno de transformación. Así fue como en 1944 junto a sus colegas de la Univ. de Rockefeller Colin MacLeod y Maclyn McCarty encontraron que podían eliminar las proteínas, los lípidos, los polisacáridos y el ARN extraídos de las bacterias S sin disminuir la propiedad de transformar a los neumococos R en S. Por otra parte, si purificaban el ADN de las bacterias y lo incubaban con las bacterias R, éstas se transformaban en S. Por lo tanto, concluyeron que era el ADN el principio transformante que hacía que los neumococos R se transformaran en S. En efecto, se descubrió que era el ADN el que llevaba la información necesaria para que la cepa R fuera capaz de sintetizar una cápsula de polisacáridos idéntica a la que poseían las bacterias S.
A pesar de esto, cuando Avery, MacLeod y McCarty publicaron sus resultados en 1944, fueron muy pocos los que creyeron que los genes eran parte del ADN. En esa época era difícil de imaginar que una molécula compuesta sólo de cuatro bases nitrogenadas diferentes pudiera llevar toda la información genética que precisaban los seres vivos. Se creía, entonces, que eran las proteínas las candidatas para tal función, debido a su gran complejidad y múltiples formas.

El material hereditario
Si bien al período entre 1900 y 1940 se lo consideraba la edad de oro de la genética, hasta ese momento, los científicos creían que el material hereditario eran las proteínas.
En 1952 Alfred D. Hershey y Martha Chase realizaron una serie de experimentos destinados a dilucidar si el ADN o las proteínas eran el material hereditario.
Trabajaron con bacteriófagos o fagos, que son virus que infectan bacterias. Debido a que los fagos están compuestos sólo por una cabeza proteica que guarda en su interior ADN, eran la herramienta ideal para resolver la naturaleza del material hereditario.

Figura: Los bacteriófagos son un tipo de virus que atacan a las bacterias. Están constituidos por ADN y una cubierta de proteínas. En la actualidad se sabe que los bacteriófagos infectan una célula inyectándole su ADN, el cual "desaparece" mientras toma control de la maquinaria de la bacteria que comienza a fabricar nuevos virus.
Fuente: http://www.biologia.edu.ar/adn/adntema0.htm

Su experimento consistió en marcar el ADN y las proteínas, con alguna sustancia que los hiciera visibles, como los isótopos radioactivos, esto permitiría ver cuál de ellos entraba en la bacteria. Ese sería el factor transformador de Griffith.
Dado que el ADN contiene fósforo (P) en su grupo fosfato pero no azufre (S), ellos marcaron el ADN con Fósforo-32 radioactivo. Por otra parte, las proteínas no contienen P pero si S, y por lo tanto se marcaron con Azufre-35 radioactivo.
Hershey y Chase encontraron que el S-35 quedaba fuera de la célula mientras que el P-32 se lo encontraba en el interior. Por lo tanto, dedujeron que durante la infección el ADN del fago entra en la bacteria, dejando afuera la cabeza proteica. Es decir que el ADN lleva la información para hacer más fagos hijos dentro de la bacteria. En otras palabras, el experimento indicaba que era el ADN el portador de la información genética del fago.
Esta conclusión coincidía con la obtenida por Avery, MacLeod y McCarty, que indicaba que el ADN era el material genético de las bacterias. Sin embargo, fue el experimento de los fagos el que disipó las dudas sobre la composición química de los genes: eran parte del ADN y, por lo tanto, estaban integrados por los cuatro tipos de nucleótidos.

Las reglas de Chargaff
Como se mencionó anteriormente, para esa época prevalecía la idea de que el ADN era una molécula demasiado simple como para ser considerada portadora de la información genética. Esta idea fue desechada en 1950 por el científico checo Erwin Chargaff del Instituto Rockefeller, quien analizó en detalle la composición de bases del ADN extraído de diferentes organismos. Llegó a la sorprendente conclusión de que las cuatro bases nitrogenadas no se encontraban en proporciones exactamente iguales en las distintas especies, lo cual sugirió que el ADN no debía ser tan monótono como se pensaba.
Chargaff demostró que, independientemente del origen del ADN, la proporción de purinas era igual a la de pirimidinas. Es decir, adenina (A) aparecía con tanta frecuencia como la timina (T) y la guanina (G), con tanta frecuencia como la citosina (C). Había dos juegos de equivalencias, A y T por un lado y G y C por otro.
Este resultado reflejaba por primera vez un aspecto estructural del ADN. Indicaba que, independientemente de la composición de A o de G en un ADN, siempre la concentración de A es igual a la de T y la de C igual a la de G. Sin embargo, en aquel momento Chargaff no sospechó las implicancias que podían tener estas reglas, denominadas más tarde “reglas de Chargaff”, en el esclarecimiento de la estructura del ADN.

El descubrimiento de la doble hélice
A principios de la década de 1950 existía un programa científico de investigación del ADN, sus propiedades, métodos de extracción y composición en las diferentes células. Tres grupos de investigadores trabajaban simultáneamente en la estructura del ADN. Uno de ellos, el del químico de Oregon Linus Pauling y sus colegas, formuló un modelo que resultó ser equivocado, en el cual la molécula de ADN debía estar formada por una triple hélice.
En el segundo equipo del King's College de Londres, liderado por Maurice Wilkins, trabajaba la cristalógrafa británica Rosalind Franklin. Ella fue la primera en obtener una excelente fotografía del ADN por difracción de rayos X, a partir de la cual podía deducirse la distribución y la distancia entre los átomos que formaban parte del ADN.
Fuente: “Los tres caminos hacia la doble hélice” de Miguel de Asúa. Revista Ciencia Hoy, Volumen 13 N° 76, Agosto -Setiembre 2003.

Figura: Rosalind Franklin y la fotografía del ADN por difracción de rayos X que lograra obtener en 1952. Los rayos X pueden difractarse -ser dispersados- al atravesar un cristal, ya que el cristal está formado por redes de átomos que actúan como tramas de difracción muy finas. Los diagramas resultantes pueden fotografiarse y analizarse para determinar la distancia entre los átomos del cristal. El estudio de fotografías obtenidas por esta técnica en cristales de macromoléculas biológicas fue fundamental en el descubrimiento de la estructura del ADN..

Cuenta la historia que mientras Wilkins y Franklin intentaban traducir sus datos en una estructura probable, la fotografía fue vista por el biólogo estadounidense James Watson y el físico británico Francis Crick, los cuales formaban el tercer equipo que estaba investigando la estructura del ADN en la Univ. de Cambridge.
Watson y Crick tenían en mente una serie de posibles estructuras, pero al carecer de buenas fotografías no podían concluir sobre cuál era la correcta. Acceder a la fotografía de Franklin fue clave para lograrlo. De esta forma, Watson y Crick pudieron publicar en 1953, en el mismo número de la revista Nature en el que publicaron sus fotografías Wilkins y Franklin, la estructura de doble hélice del ADN. Watson y Crick inician su artículo original de esta manera:
“Deseamos sugerir una estructura para el ácido desoxirribonucleico (ADN). Esta estructura tiene características novedosas que son de considerable interés desde el punto de vista biológico”.

Figura. Según el modelo de Watson y Crick, el ADN es una doble hélice, con las bases nitrogenadas dirigidas hacia el centro, perpendiculares al eje de la molécula (como los peldaños de una escalera caracol) y las unidades azúcar-fosfato a lo largo de los lados de la hélice (como las barandas de la escalera). Las hebras que la conforman son complementarias (deducción realizada a partir de los datos de Chargaff), Adenina se aparea con Timina y Citosina con Guanina y el apareamiento se mantiene debido a la acción de los puentes hidrógeno entre ambas bases. Ellos calcularon las distancias exactas que debía haber entre las cadenas y entre los átomos que las componen.

La estructura de la doble hélice sin duda revolucionó la biología molecular y proporcionó respuestas a muchas preguntas que se tenían sobre la herencia. Predijo la autorreplicación del material genético y la idea de que la información genética estaba contenida en la secuencia de las bases.
La investigación siguió su curso. El bioquímico estadounidense Arthur Kornberg anunció la purificación parcial de una enzima, la ADN polimerasa, que cataliza (acelera) la síntesis del ADN.
Fuente: http://www.argenbio.org/h/biotecnologia/03.php

En 1962 James Watson, Francis Crick y Maurice Wilkins recibieron el premio Nobel en medicina por el descubrimiento de la estructura del ADN. Rosalind Franklin había fallecido en 1958, a los 37 años de edad.

Una línea en la historia de la biología molecular

La publicación de la estructura del ADN en 1953, sentó las bases para el desarrollo de nuevas áreas de investigación como la biología molecular y la biotecnología. Entre los aportes más importantes se pueden nombrar:

1956: Vermon Ingram, del laboratorio de Estructura Molecular MRC, en Cambridge, descubre que la anemia falciforme era causada por el cambio de un aminoácido en la hemoglobina, la molécula que lleva el oxígeno en la sangre. Análisis posteriores revelaron que se debía a la mutación o cambio de un nucleótido en la secuencia de ADN que codifica para esa proteína.
1958: Matthew Meselson (Univ. de Harvard) y Franklin Stahl (Univ. de Oregon) probaron la naturaleza semiconservadora de la replicación del ADN. Esto significa que cada una de las dos moléculas copiadas de ADN formadas durante la replicación de ADN están constituidas por una hebra de la molécula original y la nueva hebra sintetizada a partir de la hebra original.
1961-1966: Francis Crick y el genetista británico de origen sudafricano Sydney Brenner descubren la forma en que se organizan las bases del ADN para producir aminoácidos. Su teoría es confirmada en 1966 por el biólogo norteamericano Marshall Nirenberg, Heinrich Mathaei y el bioquímico español Severo Ochoa, quienes descifraron el código genético para cada uno de los 20 aminoácidos.
1970-1973: Nacimiento de la ingeniería genética. Científicos en diversas partes del mundo comienzan a experimentar cortando y uniendo segmentos de ADN para realizar distintas combinaciones (ADN recombinante). Los biólogos Paul Berg y Herb Boyer de la Univ. de Stanford y Univ. de California produjeron las primeras moléculas combinadas de ADN en 1972, y en 1973 S. Cohen y A. Chang demuestran que el ADN recombinante puede ser replicado y mantenido en la bacteria E. coli.
1975: El doctor argentino César Milstein y el doctor alemán George Kholer, del Laboratorio de Biología Molecular de la Univ. de Cambridge descubrieron los anticuerpos, que son una de las armas que tiene el sistema inmune para luchar contra las enfermedades y son fabricados por células específicas. Estos científicos lograron mantener anticuerpos en cultivo fuera del organismo y mezclarlos con células tumorales, con lo cual logró un mecanismo "artificial" de reproducción de anticuerpos en su forma más pura. Ese hallazgo, permitió el diagnóstico de enfermedades y simplificó testeos, como el del grupo sanguíneo, el HIV o el embarazo.
1975-1977: Comienzan los análisis al genoma. Ed Southern de la Univ. de Edimburgo, desarrolla una prueba que comenzaría uno de los proyectos más ambiciosos de la ciencia moderna: la secuenciación del genoma humano. La prueba se conoce como "Southern Blotting" y permite que el investigador que trabaja con un segmento de ADN conozca el lugar en el que estaba ubicado dentro del genoma antes de que fuera fragmentado.
1977: Fred Sanger (Univ. de Cambridge) desarrolló una técnica para leer el ADN “letra por letra” (nucleótido por nucleótido o base por base).
1984: El investigador inglés Alec Jeffreys, del Laboratorio de Estructura Molecular de la Univ. de Cambridge descubrió una forma de leer las “huellas dactilares” del ADN, o “huellas genéticas” para cada individuo. De esta forma las personas pueden ser identificadas con tan sólo una muestra de su ADN. Sus pruebas han permitido avances en estudios forenses, criminología, en pruebas para determinar la paternidad y el parentesco entre individuos, y en estudios de evolución biológica.
1985: K. Mullis describe su método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite conseguir múltiples copias de una secuencia de ADN dada.
1990: El Proyecto Genoma Humano es lanzado este año. El propósito era localizar cada gen en el genoma humano. En 1995, los estadounidenses Craig Venter, Claire Fraser, Hamilton Smith y otros investigadores de la empresa Celera Genomics, completaron la secuencia del primer genoma de un organismo vivo, la bacteria Hemophilus influenzae.
1991: Nace Tracy, la primera oveja transgénica, que producía en su leche una proteína humana, la alfa-1-antitripsina.
1997: Nace la oveja Dolly, el primer mamífero adulto clonado por Ian Wilmut y sus colegas en el Instituto Roslin en Bélgica.
1999-2001: Se completa la primera secuencia del cromosoma humano número 22. El primer ensayo del genoma humano es anunciado en el año 2000 y otros genomas, de plantas y bacterias son secuenciados. En el 2001 se ensaya por primera vez la terapia genética donde los fallos en los genomas de los pacientes son tratados con copias saludables de los genes alterados.
2002: Se publica el primer borrador completo de la secuencia del genoma humano.
2002: Nace en Argentina Mansa, la primera ternera clonada y transgénica que produce la hormona de crecimiento humana en su leche. Este logro argentino fue concretado por la empresa de biotecnología Biosidus.

2004: En Argentina nace Pampero, el primer ternero transgénico en el mundo que produce la hormona de crecimiento humana.

Como dicen los científicos argentinos Alberto Díaz y Diego Golombek en su libro “ADN, 50 años no es nada”:

“Desde que Watson y Crick descubrieron por primera vez la estructura del ADN que permitía, además, explicar los mecanismos de duplicación celular, comenzó esa gran aventura del conocimiento y del ingenio que es la biología molecular. Sin embargo han pasado cincuenta años y, por suerte, seguimos descubriendo el misterio; como decía César Milstein, la curiosidad seguirá abriendo caminos y resultados”.

Cuaderno 01

2008-02-07T12:26:00.000-02:00

El objetivo de este Cuaderno es profundizar en la información que habitualmente se encuentra en los libros de texto acerca del conocimiento de la célula. Esto implica conocer algunas de las técnicas que permiten ver o medir los componentes celulares, los procesos celulares, y comprender cómo se interpreta esa información.
El hecho de que un contenido como “la célula” ocupe espacio y tiempo en la currícula no se debe sólo a su importancia como contenido de la biología, sino también a la dimensión que alcanza la célula en el nuevo contexto de desarrollo tecnológico y social. Por ejemplo, para comprender los procesos que emplea la biotecnología moderna y sus aplicaciones actuales y futuras, es preciso comprender la estructura y el funcionamiento celular.
Comprender un objeto invisible a simple vista como la célula requiere de la construcción de una imagen (funcional y estructural) o de una representación abstracta con relaciones y procesos complejos.

¿Cómo se estudia la célula?

Hoy en día existe mucha información disponible acerca de qué es una célula, si es procariota o eucariota, cuáles son sus componentes, su forma, su función, etc. De hecho, estos contenidos son habituales y básicos en la enseñanza escolar. Pero, estudiar la estructura y el funcionamiento celular no es una tarea sencilla. Para lograrlo, hay que entrar en un mundo microscópico a través de numerosas herramientas, desde las más sencillas como el microscopio óptico, hasta técnicas más sofisticadas que permiten discernir la estructura de las macromoléculas, sus movimientos y funciones. Los conocimientos actuales acerca de las células son el resultado de observaciones, teorías y modelos que se fueron construyendo y modificando a lo largo de años de investigación, un proceso que aún continúa.

Estructura de una célula eucariota animal.

Los modelos científicos
La ilustración es un modelo que representa la estructura de una célula eucariota animal. Los modelos científicos se caracterizan porque son construcciones de la mente humana, y representan ideas o conceptos que se tienen sobre algún aspecto de la realidad. Los modelos científicos cumplen un papel importante en la construcción del conocimiento y la comprensión de los fenómenos naturales. Ayudan a predecir, describir y explicar fenómenos naturales, objetos y estructuras; y simplifican las observaciones haciendo más fácil trabajar con ellos, especialmente cuando se trata de objetos que no se perciben a simple vista, como una estructura microscópica.

¿Cómo se llega a determinar un modelo de la célula que no solo representa su estructura sino también su función? Sin duda, el desarrollo de instrumentos ópticos cada vez más precisos y de técnicas moleculares de visualización, han desempeñado un papel preponderante en estos logros científicos ya que permitieron conocer lo inalcanzable para el ojo humano.

Un poco de historia…
Ya en la antigüedad se sabía que el tamaño de los objetos podía aumentarse empleando espejos curvos y esferas de cristal llenas de agua. A principios del siglo XVII se inició una serie de experiencias utilizando lentes con el objetivo de lograr el mayor aumento posible. Estas experiencias se inspiraron en el uso del telescopio que había sido empleado por primera vez en 1609 por Galileo con fines astronómicos.
Con el desarrollo de los microscopios, la biología experimentó una revolución, ya que hasta entonces los organismos más pequeños descriptos eran los insectos diminutos. A partir de entonces, el desarrollo y complejización de los microscopios (palabra que en griego significa “para ver lo pequeño”) fue constante.
En 1665, el científico Robert Hooke publicó un libro llamado Micrographia; en el que pueden encontrarse algunos de los mejores dibujos que se hallan hecho de observaciones microscópicas. Una de sus observaciones simples pero más importantes fue la de un delgado trozo de corcho, un material muy liviano y firme que flotaba en agua, por razones desconocidas hasta entonces. A través de su microscopio Hooke observó que estaba constituido por una fina trama de pequeñas celdas a las que él llamó “células”, un término habitual para designar pequeñas habitaciones en los monasterios.

Microscopio usado por Hooke y el dibujo de las “células” del tejido de corcho

Más tarde, el aficionado holandés Anton van Leeuwenhoek logró, mediante las lentes pequeñas que él mismo fabricaba, aumentos de hasta 270 veces. Así pudo, entre otras cosas, descubrir y estudiar por primera vez a pequeños organismos invisibles a simple vista, presentes en aguas estancadas, a los que nombró “animálculos”. Hoy se sabe que observó
desde células bacterianas hasta protozoos en aguas estancadas, espermatozoides y glóbulos rojos.

Microscopio usado por Van Leeuwenhoek

¿Qué es un microscopio?

El microscopio es una de las herramientas básicas en el estudio de la biología. Mediante un conjunto de lentes, el microscopio aumenta el tamaño de objetos que son demasiado pequeños para ser visualizados a simple vista. Dos principios están involucrados en el uso del microscopio: la magnificación (capacidad de aumentar el tamaño de una imagen) y la resolución (capacidad de producir una imagen nítida, o la capacidad del instrumento para dar imágenes bien definidas de puntos situados muy cerca uno del otro). Existen distintos tipos de microscopios, cada uno con un propósito particular, ya que cada técnica de microscopía permite observar estructuras dentro de cierto rango de tamaño, dependiendo del límite de resolución del microscopio empleado, es decir, la separación mínima que permite que dos objetos puedan ser distinguidos como diferentes.

Los microscopios actuales
Desde su invención, la microscopía ha experimentado increíbles adelantos, aumentando no solo su capacidad de resolución sino también el poder de amplificación. Se los puede clasificar en dos grandes grupos: microscopios ópticos y microscopios electrónicos.
La gran diferencia entre ambos tipos es la “radiación” que emplean para iluminar el objeto de interés y el límite de resolución, que depende de las características físicas de la radiación empleada (luz visible o electrones). En el caso de los microscopios ópticos, la radiación utilizada es la luz visible. En los microscopios electrónicos, la radiación es un haz de electrones, posibilitando un poder de resolución de 0,1nm.

Los microscopios ópticos

Estructura del microscopio óptico (A: esquema; B: foto). (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).

Consta de una o más lentes, y su factor limitante son las características físicas de la luz visible (su longitud de onda). De todas formas, pueden aumentar el tamaño de un objeto por encima de las 2.000 veces. Algunas partes del microscopio óptico son: OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador, que amplía la imagen del objetivo; OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación, que amplía la imagen de ésta; CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación (o espécimen a estudiar).

Es el tipo de microscopio más utilizado, y emplea la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto.

Variantes en la microscopía óptica
En la microscopía óptica se pueden distinguir variantes que ofrecen diferentes imágenes de un mismo objeto de estudio. Según cuál es el material de estudio, sus características y el objetivo de quien lo examina, se elegirá una u otra técnica. A continuación se muestran cuatro imágenes de la misma célula (un fibroblasto en cultivo) generada mediante diferentes técnicas de microscopía óptica, que se explican a continuación:

A) Microscopía de campo brillante (B) Microscopía de contraste de fase (C) Microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC) – Nomarski. (D) Microscopía de campo oscuro (tomada de Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004)

A) Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que están naturalmente coloreados, o simplemente contornos.

B) Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para especimenes delgados, o células aisladas. El tipo de iluminación que emplea provoca variaciones en cómo refractan la luz algunos especimenes “invisibles”, haciéndolos visibles. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina.

C) Microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC) – Nomarski: Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Se usa cuando la muestra es muy gruesa para usar contraste de fases. Fue diseñado para observar relieves de especimenes difíciles de manejar. Es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales.

D) Microscopía en campo oscuro: el microscopio utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. Las porciones claras del ejemplar aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal.

Fijación, corte y tinción de muestras

Para que una muestra de tejido permanezca intacta en el tiempo, y permita así su observación al microscopio todas las veces que se desee, hay que “fijarla”. Esto significa, tratar a las células con un fijador que las inmovilice y las preserve. Luego, dado que la mayoría de los tejidos son muy gruesos como para poder observar sus células individualmente a alta resolución, se los debe cortar en pequeñas láminas o secciones con un instrumento denominado “micrótomo” (figura). Debido a que los tejidos son generalmente blandos y frágiles (aún fijados), necesitan ser embebidos en un medio que actúe de soporte para poder seccionarlo. Generalmente se emplea parafina (también algunas resinas), que en su estado líquido penetra el tejido fijado, para luego solidificarse y así formar un bloque sólido junto a la muestra.

Esquema de un micrótomo. Una porción de tejido embebido en parafina es seccionada con una cuchilla de acero para luego teñir y observar al microscopio óptico. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004)

Una vez obtenidas las secciones, usualmente el siguiente paso es teñirlas con colorantes específicos que poseen afinidad por distintos componentes celulares, permitiendo su identificación al microscopio. Algunos ejemplos de colorantes muy empleados son la hematoxilina y la eosina. El primero tiene afinidad por las moléculas cargadas negativamente, por lo que se emplea para teñir los núcleos celulares (por su contenido de ADN) que adquieren un color violáceo. El segundo tiene afinidad por las sustancias básicas, otorgando un color rosado al citoplasma celular cuya carga neta es positiva.
Sección de tejido teñida observada con un microscopio óptico de campo brillante. La sección observada corresponde a las células de los conductos colectores de orina del riñón, y fue teñida con una combinación de hematoxilina y eosina. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).

E) Microscopía de campo brillante con tinción: Los colorantes específicos aumentan el contraste y revelan detalles que no se aprecian de otra manera.

Sección de tejido teñida observada con un microscopio óptico de campo brillante. La sección observada corresponde a las células de los conductos colectores de orina del riñón, y fue teñida con una combinación de hematoxilina y eosina. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).

F) Microscopía de fluorescencia: se emplean sustancias naturales de la célula o colorantes que tienen la capacidad de absorber determinadas longitudes de onda, y emitir luz fluorescente. Se utiliza para detectar proteínas u otras moléculas específicas en una célula. Para lograrlo se puede acoplar la molécula fluorescente a otra molécula capaz de reconocer al componente que interesa visualizar, o emplear moléculas fluorescentes que directamente tengan afinidad con determinados componentes celulares. Se pueden combinar distintos compuestos fluorescentes para detectar distintas moléculas en la misma muestra.

Microscopía de fluorescencia. Se observa una micrografía de una célula en mitosis. Para obtener esta imagen, se emplearon tres moléculas fluorescentes distintas con el fin de teñir tres componentes celulares diferentes. Se usó un anticuerpo acoplado a una proteína fluorescente verde para detectar a los microtúbulos, otro anticuerpo acoplado a una proteína fluorescente roja para detectar a los centrómeros, y un colorante fluorescente azul para teñir el ADN, que se encuentra condensado formando los cromosomas. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).

G) Microscopía confocal: permite obtener imágenes tridimensionales, a diferencia de la microscopía óptica. El microscopio óptico convencional enfoca un determinado “plano focal” dentro de una estructura tridimensional; por encima y por debajo de dicho plano la muestra está iluminada pero no en foco, y esto genera una imagen borroneada. El microscopio confocal combina dos enfoques: óptico y computacional. Esto elimina las imágenes provenientes de otros planos que no sean los que se desea enfocar en cada momento. Las imágenes se integran mediante computadoras para obtener una imagen tridimensional.

Comparación de la microscopía fluorescente convencional y confocal. Las dos imágenes se obtuvieron del mismo estadio de desarrollo de un embrión de la mosca Drosophila, donde se tiñeron los filamentos de actina de las células con un colorante fluorescente. (A) En la microscopía convencional, la imagen es borrosa debido a la presencia de estructuras fluorescentes por encima y por debajo del plano de foco. (B) en la imagen confocal, la información “fuera de foco” es removida, resultando en una observación nítida de la sección de células del embrión (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004)

Los microscopios electrónicos
Desarrollados a partir de 1930, permiten una ampliación del objeto mucho mayor que el microscopio óptico, con muy alta capacidad de resolución. Permiten observar virus y organelas subcelulares, entre otras estructuras. Básicamente, dos tipos de microscopios electrónicos fueron desarrollados para diferentes usos:

A) Microscopio electrónico de transmisión (MET): proyecta electrones (partículas subatómicas con carga negativa) a través de una fina capa de tejido o material a observar. Al hacerlo, produce una imagen en dos dimensiones sobre una pantalla fosforescente, donde el brillo en un área particular de la imagen es proporcional al número de electrones que son transmitidos a través del material.

B) Microscopio electrónico de barrido (MEB): da como resultado una imagen que parece tridimensional. Emplea dos o tres puntos de la muestra donde llegan los electrones que escanean la superficie del espécimen a observar y salen del mismo siendo detectados por un sensor.

1. Imagen de la bacteria Escherichia coli a través de microscopio electrónico de transmisión (aumento 92.750x) http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery/fungi-sm1/92386a.html. Se nota dentro de la célula, coloreado en rojo, el área donde se sitúa el ADN. En esta imagen la bacteria se halla en proceso de división.
2. Imagen de bacterias E. Coli a través de microscopio electrónico de barrido. Se genera una imagen tridimensional (aumentos 22.810x) http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery/fungi-sm1/92386a.html.
Los colores de las imágenes no son reales, ni producto de colorantes, sino que se generan artificialmente mediante programas de diseño para destacar el objeto de interés.

De lo expuesto se concluye que se optará por uno de los tipos de microscopía descriptos según el objetivo de estudio, el tamaño de las estructuras que permiten visualizar, el detalle que aportan, las moléculas que permite distinguir, entre otros criterios. El siguiente esquema muestra las posibilidades que ofrecen los diferentes aparatos ópticos en relación con la resolución del ojo humano.

Se compara el poder de resolución de los diferentes microscopios y del ojo humano. La escala graficada es logarítmica (Adaptado de Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004)

¿Cómo se estudian las moléculas que integran la célula?

Muchos procesos celulares pueden estudiarse combinando las técnicas microscópicas con otras herramientas. Actualmente se dispone de técnicas que permitan detectar, medir y realizar seguimientos de casi todas las moléculas presentes en una célula viva. Entre ellas:

Proteínas fluorescentes: El descubrimiento de proteínas fluorescentes presentes en distintos organismos, como la Proteína Verde Fluorescente (GFP en inglés) extraída de:
- Aequoria victoria, abrió paso a innumerables aplicaciones en el campo de la biología celular. La caracterización del gen que la codifica permitió, por ingeniería genética, emplearla como “etiqueta” para señalar otra proteína de interés a la cual se fusiona. Un ejemplo se puede observar en la microfotografía de plantas transgénicas de la especie modelo Arabidopsis thaliana que lleva una nueva proteína resultante de la unión de la proteína GFP con otra proteína de estudio denominada “talina”. De esta forma, se puede estudiar en un organismo completo la ubicación y el comportamiento de una proteína particular.

Estudio de proteínas por fusión a la proteína GFP
A) la superficie de las hojas de Arabidopsis cubiertas de estructuras glandulares llamadas tricomas. (B) la microscopia confocal MEB permite observar la proteína “talina” debido a su unión con la proteína fluorescente verde GFP. En rojo se observa la autofluorescencia de la clorofila. (Fuente: Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004).

Uso de radioisótopos para seguir el destino de moléculas en la célula :

Las moléculas pueden ser marcadas o etiquetadas con isótopos radioactivos. Los isótopos constituyen variantes de los diferentes elementos químicos que cambian en la masa de su núcleo, aunque poseen el mismo número de protones y de electrones, y las mismas propiedades químicas. Los isótopos radioactivos, o radioisótopos, tienen un núcleo inestable que se desintegra para producir un tipo de átomo diferente. En el transcurso de la desintegración se pueden liberar distintos tipos de radiaciones (por ejemplo, rayos gama) que son detectadas por dispositivos especiales. Dado que existen radioisótopos de muchos de los elementos que componen a la mayoría de las moléculas presentes en la célula, se han desarrollado técnicas para el seguimiento y localización de moléculas específicas, tanto bioquímicamente como microscópicamente. Una de las primeras aplicaciones de la radioactividad en biología fue el seguimiento de la ruta del elemento carbono durante la fotosíntesis en la síntesis de carbohidratos. Luego se comenzó a emplear para seguir cualquier proceso en las células.
En un experimento típico, las células son suplementadas con una molécula precursora en su forma radioactiva que se mezcla con las moléculas no marcadas preexistentes. Así, todas siguen el mismo camino ya que son “vistas” por la maquinaria celular como la misma molécula. Otro de los usos importantes de la radiactividad en la biología celular es la localización de un compuesto radiactivo en la célula o en un tejido por autoradiografía. Brevemente, las células se incuban en presencia de la molécula radioactiva durante un lapso breve de tiempo, y luego se las fija para su observación microscópica. Se las cubre posteriormente con una capa delgada de emulsión fotográfica, y luego de varios días en oscuridad se puede revelar y se observará la localización de la radiactividad en cada célula.